ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Электрофорез в градиенте ПААГ из "Практическая химия белка" Сущность метода состоит в том, что под действием электрического поля белковые зоны мигрируют в полиакриламидном геле с уменьшающимися размерами пор до некоторого конечного положения, обусловленного сопротивлением среды. Таким образом, расстояние, пройденное зоной белка, связано с молекулярной массой, которую можно определить путем сравнения с поведением белков-маркеров. [c.17] Хотя белки с небольшим суммарным зарядом имеют низкую электрофоретическую подвижность, конечное положение зон практически не зависит от величины заряда при условии, что все исследуемые белки имеют заряд одного знака, а pH буфера заметно отличается от их изоэлектрических точек. [c.17] Линейный градиент концентрации создают с помощью двух сообщающихся сосудов цилиндрической формы и перистальтического насоса или же с помощью градиентного смесителя иного, более сложного типа [ИЗ]. При недостатке опыта готовить градиентные гели высокого качества и с хорошей воспроизводимостью бывает затруднительно, в таких случаях можно воспользоваться готовыми пластинами (фирмы Сгас11рогс, ЬКВ, РЬагтас1а). [c.18] Белки с молярной массой 13 000—100 000 фракционируют в гелях с градиентом концентрации 4—307о для белков с молярной массой 200 000—1 000 000 используют гель с градиентом 4--16%. Гель вначале уравновешивают рабочим буферным раствором. Для этого проводят предварительный электрофорез при 150 В в течение 1 ч. [c.18] Проведение электрофореза. Для приготовления запасного электродного буфера (трис — ЭДТА — борная кислота) растворяют в дистиллированной воде 121 г триса, 15,6 г ЭДТА (дн-натриевой соли) и 9,2 г борной кислоты, объем раствора доводят до 1 л. Перед употреблением запасной раствор разбавляют дистиллированной водой (1 10). [c.18] Обработку геля ведут в фотографической кювете, накрытой крышкой с целью уменьшить испарение метанола. Время от времени (примерно каждый час) кювету покачивают. Раствор красителя (его можно использовать до 20 раз) сливают в склянку с притертой пробкой и в кювету заливают раствор для обесцвечивания. Если раствор для отмывки не содержит поглощающих краситель материалов (отрезок шерстяной ткани размеро 100x100 мм, губчатая резина, гранулы ионита), то раствор заменяют на свежий 2—3 раза в течение 24 ч. Хранят гель в 10%-ной уксусной кислоте. Разработан электрофоретический способ отмывки красителя, однако иногда такая отмывка сопровождается обесцвечиванием белковых зон. [c.19] Градуировочный график для градиентного (4—30%) ПААГ, построенный с использованием в качестве белков-маркеров тироглобулина, феррити-на, каталазы, лактатдегидрогеназы и бычьего сывороточного альбумина [101]. [c.20] Вернуться к основной статье