Электрофорез в градиенте ПААГ

Электрофорез в градиенте ПААГ [5, 98, 112, 113] [c.17]

Электрофорез в ПААГ не получил широкого распространения в качестве препаративного метода фракционирования и очистки белков. Одна из причин этого, по-видимому, состоит в трудности осуществления равномерного теплоотвода из большой массы геля любой конфигурации (цилиндрической, кольцевой или плоской). Неравномерность теплоотвода и возникающие в геле градиенты температуры приводят, как уже отмечалось, к резкому ухудшению качества разделения белков. [c.116]

Максимальное разделение достигается при использовании диск-электрофореза в ПААГ. (Название диск — от дискретного напряжения электрического поля, что обеспечивается прерывистым градиентом pH в системе.) Суть метода заключается в следующем. В стеклянной вертикальной трубке полимеризуют гель неодинаковой концентрации. Верхняя часть (область образца до 100 мкм толщиной) и средняя (прокладка) имеют меньшую концентрацию, чем нижняя часть — разделяющий гель. Образец наносят на верхнюю часть геля. (Иногда верхний гель [c.113]

Мы попытались обнаружить активную тетрамерную форму методом электрофореза в градиенте ПААГ. Для повышения доли активной формы гомогенный препарат фермента а-типа с Мг 180000 инкубировали с субстратами в течение 2 сут при +4° С, [c.155]

С помощью электрофореза белков в градиенте ПААГ и изоэлектрофокусирования было показано, что закаленные и незакаленные [c.52]

По существу, картина разделения белковых зон при электрофорезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соотношения размеров белков в препарате и характера градиента пористости. Выбор буфера и электрического рея има электрофореза играет второстепенную роль. Поэтому, в частности, можно [c.74]

Направление У — электрофорез в 1%-ном геле агарозы направление 2 — электрофорез в 4%-ном ПААГ, полимеризованном в градиенте концентрации денатурирующих добавок (0—7 М мочевины и О—40% формамида) [c.136]

Преимущества электрофореза в градиенте пористости (концентрации) ПААГ были отмечены в предыдущем разделе при обсуждении фракционирования белков. По-видимому, нет оснований предполагать, что эти преимущества не будут ощутимы и при фракционировании нуклеиновых кислот. Вероятно, лучших результатов можно ожидать в денатурирующих гелях, поскольку гибкость нитей нативных нуклеиновых кислот в обычных гелях может смазывать эффект торможения полос при уменьшении размера пор. [c.142]

Широкого применения в последние годы электрофорез нуклеиновых кислот в градиенте пористости ПААГ не нашел, хотя в более ранних работах были получены многообещающие результаты. [c.142]

Анализ субъединиц глютенина с помощью электрофореза при кислых pH или двумерного электрофореза ДДС-ПААГ-ИЭФ или ДДС-ПААГ в формирующемся градиенте pH обнаруживает значительные различия их зарядов. Каждую полосу, наблюдаемую при одномерном электрофорезе и соответствующую определенной молекулярной массе, можно посредством электрофокусирования разделить на большое число белков, отличающихся своими изоэлектрическими точками. Так, по Данно и др. [57], субъединицы с предполагаемой молекулярной массой в пределах [c.208]

Для фракционирования РНП авторы той же работы использовали экспоненциальный градиент (2—6%) концентрации ПААГ (С=4,8). Электрофорез проводили в кварцевых трубках длиной 17 Ы. Во избежание конвекции при полимеризации одновременно создавали градиент концентрации глицерина (2,5—20%). Трубки заполняли сверху в наклонном положении. Для улучше- [c.142]

Присутствие ММФ в препаратах НАД-киназы из скелетных мышц кролика было продемонстрировано также при фракционировании на колонке с сефадексом С-200 (3), а значения молекулярных весов олигомеров фермента были уточнены с помощью метода электрофореза в линейном градиенте концентрации полиакриламидного геля (ПААГ) [16]. Результаты, полученные при исследовании фермента двумя указанными методами, показали, что в частично очищенных препаратах НАД-киназы присутствуют олигомеры фермента с молекулярными весами 31000, 65000, 94 ООО, 60 ООО, 220 ООО, 350 ООО. Наименее ассоциированной формой НАД-киназы является белок с молекулярным весом 31 ООО, который, по-видимому, можно считать субъединицей фермента на том основании, что после обработки додецилсульфатом натрия двух низкомолекулярных фракций, снятых с колонки (31 ООО, 5 000), и последующего электрофореза на электрофореграммах не был обнаружен белок с молекулярным весом, меньшим 30 ООО. [c.138]

Значения молекулярных весов разных форм НАД-киназы, определенные методом гель фильтрации, совпадают с величинами, определенными методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ, за исключением низкомолекулярной формы НАД-ки- 230, назы с молекулярным весом 45000, которую при гель-фильтрации обнаружить не удавалось. [c.139]

Однако при анализе сошедшей с колонки фракции НАД-киназы, имеющей молекулярный вес 90000, методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ было показано наличие в ней, помимо белка с исходным молекулярным весом 90000, еще двух с молекулярными весами 45000 и 180000. Эти данные указывают на возможность перехода одних молекулярных форм в другие. [c.139]

Третий сегмент РНК кодирует кислый полипептид РА, имеющий у вируса PR8 м.м. 82 400 [61]. На основании данных секвенирования [25 J. Robertson, I. Roditi, в печати] и двухмерного электрофореза в ПААГ с неуравновешенным pH и градиентом SDS [98, 100] -считают, что продукт сегмента 3 является кислым белком у всех изученных штаммов вируса гриппа А и В. [c.219]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

Электрофорез во втором направлении проводили по методу Лэммли, в пластине размером 20X16X0,15 см, используя вогнутый экспоненциальный градиент ПААГ (10—30%). Для того чтобы осуществить непосредственный контакт цилиндрика геля первого направления с торцом геля второго направления, при заливке последнего стеклянную форму наращивали резиновым кольцом и смесь мономеров заливали до уровня на 5 мм выше верхних краев стеклянных пластинок формы. После полимеризации кольцо снимали и гель обрезали вровень с краями стекол. Цилиндрик геля в этом случае можно не заливать агарозой, а просто прижать к торцу пластины, уложив на него стеклянную палочку, которую через 30 мин после начала электрофореза можно снять. Электрофорез начинали при силе тока 30 мА, з далее вели в течение 18 ч при 11 мА. Белки фиксировали в геле 10%-ным раствором СНзСООН в 40%-ном этаноле радиоактивные пятна регистрировали флюорографически. [c.56]

Градиентами пористости ПААГ можно, как мы видели, пользоваться и для разделения комплексов белок—ДДС-Na. Ламбен обнаружил, что для белков, обработанных ДДС-Na, линейный градиент концентрации ПААГ в интервале 3—30%> позволяет проводить электрофорез до полной обстановки белков с молекулярными массами от 13 до 950 тыс. дальтон. При этом справедливо следующее линейное соотношение IgM =yi Ig Т+В, гдеМ— молекулярная масса белка, а Т—концентрация ПААГ в месте расположения белковой полосы. Для линейного градиента эта концентрация легко вычисляется по расстоянию полосы от начала пластины. А и В—коэффициенты, указывающие на линейный характер зависимости. Определять их нет нужды, если имеется возможность воспользоваться, как обьино, набором маркерных белков. Обработку исходного препарата можно проводить в тех же условиях, что для обьиного электрофореза в ПААГ с ДДС-Na [Lambin, 1978]. [c.75]

Электрофорез в ПААГ нативного белка в градиенте пористости геля Электрофорез проводят в блоках полиакриламидного геля размером 110x100x1 мм (Anderson et al., 1972) (Рис. 16). [c.58]

Несложная модификация устройства фирмы Desaga позволяет наносить на пластинки линейно изменяющуюся в одном направлении по своим пропорциям смесь двух сорбентов или импрегнировать сорбент линейно возрастающей концентрацией какой-либо добавки ( Gradient TLG-spreader ). ТСХ нескольких идентичных препаратов в направлении, перпендикулярном к градиенту, позволяет выбрать оптимальную пропорцию смеси, а хроматография вдоль градиента открывает возможность разделения компонентов, сильно различающихся по своей подвижности (подобно тому как это происходит при электрофорезе в градиенте пористости ПААГ). Эти возможности, насколько нам известно, еще не использовались для фракционирования компонентов белков и НК, однако целесообразно иметь их в виду. [c.467]

При электрофорезе в градиентном геле полипептиды мигрируют до достижения зоны с определенной пористостью, препятствующей их дальнейшему продвижению. Если все комплексы полипептидов с ДСН имеют одинаковую форму, концентрацию ПААГ в этой зоне можно принять характеристической для данной молекулярной массы [97, 99, 101, 137]. Комплекс может частично разрушиться с потерей ДСН, в особенности в области, близкой к равновесному состоянию, однако это не влияет на конечный результат. Объем образца не влияет па ширину белковых зон, тем не менее наносить образец в большом объеме не рекомендуется. При электрофорезе в градиентном ПААГ формирование градиента с высокой воспроизводимостью может быть затруднительным. Однако для этих целей выпускаются преформированные гели высокого качества. [c.28]

В 1975 г. О Фаррелл опубликовал сенсационные результаты двумерного фракционирования радиоактивно меченных суммарных белков Е. oli. В первом направлении он использовал ИЭФ, а во втором — ступенчатый электрофорез в присутствии ДДС-Na с использованием градиента концентрации ПААГ. По окончании фракционирования на пластине методом авторадиографии было выявлено около 1100 пятен различных белков (рис. 14). Метод О Фаррелла получил очень широкое распространение. Разумеется, за 5 лет он претерпел ряд дальнейших модификаций, которые будут рассмотрены ниже, но сначала отметим характерные особенности оригинального метода, избегая деталей, подробно описанных автором в его первой работе [O Farrell, 1975]. [c.45]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

Другой очень эффективный способ сужения полос — использование градиента пористого геля. В этом случае при миграции вдоль геля першний край каждой полосы все время оказывается в области ч ь более концентрированного геля, чем задний. Молекулы- белка, расположенные ближе к переднему краю полосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что и приводит к непрерывному сужению полос в ходе их продвижения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстрировали специалисты фирмы РЬагтас1а на выпускаемых этой фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации ПААГ (4—30%). Начав электрофоретическое фракционирова- ние белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время диф фузий полностью размывала сформировавшиеся было белковые полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза удавалось получить четкую картину полос, содержащую все обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16). [c.45]

Техника приготовления гелей с изменяющимися бдоль йа-правления миграции белков размерами пор, или, как их называют, градиентов пористости ПААГ , была подробно описана в главе 2. Постепенное уменьшение среднего размера пор вдоль градиента достигается путем увеличения концентрации акриламида. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ имеет целый ряд существенных преимуществ. [c.74]

При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести электрофорез в простой непрерывной системе и не очень заботиться об объеме исходного препарата. Сделанное замечание находится в противоречии с цитированными выше недавними работами, где градиентный гель использовали в сочетании ео ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при таком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обусловлено определенным консерватизмом и перестраховкой . [c.74]

Указанные преимущества объясняют растущую популярность градиентных гелей, несмотря на большую сложность их приготовления по сравнению с обычным ПААГ. Легко понять, почему такая ведущая фирма, как Pharma ia , специализировалась на выпуске стандартизированных градиентных ПААГ. Фирма предлагает гели в виде пластин с рабочими размерами 78X78X2,7 мм для двух интервалов концентраций. ПААГ 2— 16% и 4—30% (РАА 2/16 и РАА 4/30). Профиль градиента пористости в этих пластинах подобран так, что в пределах некоторого диапазона молекулярных масс нативных глобулярных белков они обеспечивают линейную зависимость расстояния миграции белка (до конечного положения) от логарифма его молекулярной массы. Калибровочные данные прилагаются фирмой к каждому гелю вместе с указанием стандартных условий фракционирования. Рабочие диапазоны молекулярных масс таковы для РАА 2/16 —от 100 тыс. до 5 млн. дальтон, для РАА 4/30 —от 50 тыс. до 2 млн. Для РАА 4/30, например, это означает, что при достаточно длительном электрофорезе белки с молекулярной массой менее 50 тыс. могут выйти из геля, а имеющие массу более 2 млн. — не войдут в него. Последняя цифра может относиться, конечно, только к белковым комплексам или нуклеиновым кислотам. [c.75]

Рие. 26. Разделение гистонов сочетанием хроматографии на оксиапатите (направление I) и электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (направление II) в присутствии ДДС-Na [Bloom, Anderson, 1979] [c.81]

Интересное использование комбинации денатурирующих эффектов формамида и мочевины предложили Фишер и Лерман. По длине ПААГ создавали градиент концентрации формамида (О—40%) и мочевины (О—7 М) и вели электрофорез двунитевых рестриктов ДНК при 60°. Для каждого рестрикта в зависимости от его нуклеотидного состава на градиенте имеется точка, где происходит частичная денатурация ДНК. Как уже отмечалось, это приводит к резкому замедлению миграции, связанному С образованием локальных вздутий на гладкой молекуле ДНК. Рестрикт образует остро очерченную полосу. Таким образом, Осуществлялось фракционирование по составу рестриктов одина- <совой длины [Fis her, Lerman, 1979]. [c.137]

Молекулы белка, расположенные ближе к переднему краю полосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что и приводит к непрерывному сужению полос в ходе их продвижения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстрировали специалисты фирмы РЬагтас1а на выпускаемых этой фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации ПААГ (4— 30 %). Начав электрофоретическое фракционирование белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время диффузия полностью размывала сформировавшиеся было белковые полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза удавалось получить четкую картину полос, содержащую все обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16). [c.45]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология