ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Гель-фильтрация из "Практическая химия белка" При гель-фильтрации разделение белков происходит главным образом по размерам белковой глобулы [6, 59]. В настоящей главе рассматривается хроматография на открытых колонках, хотя сегодня в связи с созданием новых колонок, приборов, методов набивки более важным методом является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ см. гл. 6). Вместе с тем принципы разделения на открытых и закрытых колонках полностью идентичны. [c.21] Гель-фильтрацию проводят на колонках, заполненных частицами набухшего геля, имеющими поры определенного диаметра. Общий объем столбика геля обозначают К/. Общий объем можно найти расчетным путем по форме колонки или же экспериментально по объему заполняющей ее воды. В процессе элюирования крупные молекулы, не проникающие в гранулы геля, перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем, находящимся между гранулами, и элюируются в виде узкой зоны. Объем элюента, соответствующий появлению этой зоны, обозначают Уо (свободный объем). Менее крупные молекулы проходят через колонку не так быстро, так как они проникают в гранулы геля и их выход с колонки занимает продолжительное время. Поскольку степень диффузии в гранулы геля зависит от размеров молекул, вещества элюируются с колонки в порядке уменьшения их молекулярной массы. Молекулярная масса М исследуемого белка определяется путем сравнения объема элюирования Уе с аналогичным параметром для белков-маркеров. Этому вопросу посвящены исчерпывающие обзоры [1, 59] и проспекты фирмы РЬагтас1а [134]. [c.21] чтобы воспрепятствовать агрегации олигомеров. Однако в случае сефарозы эффективность разделения зависит от концентрации солей и pH [104]. Хроматографию на сефакриле рекомендуется вести при ионной силе 0,5 или при pH 5,5, поскольку этот гель проявляет слабые ионообменные свойства [19]. [c.23] Постоянную скорость элюирования задают с помощью перистальтического насоса. Элюат, собираемый на фракционном коллекторе, анализируют в потоке или выборочно по фракциям на содержание белка, для чего обычно регистрируют изменение оптической плотности при 280 нм. Другие методы детектирования используют при отсутствии в белке хромофоров (остатков триптофана и тирозина), при работе иа микроуровне или при слишком высоком поглощении при 280 нм, например благодаря присутствию кофактора. В этих случаях можно определять оптическую плотность при 220 им, интенсивность флуоресценции или радиоактивность (при работе с мечеными белками) [14, 161] наконец, при анализе белковых фракций можно использовать химическую модификацию (разд. 1.4.5.1). Например, определенные объемы (аликвотные части) отдельных фракций можно подвергнуть щелочному гидролизу и последующему анализу по реакции с нингидрином. Для обнаружения белков можно использовать реакцию Лоури или реакцию связывания кра-снтеля. Последний метод вполне можно рекомендовать как наиболее простой и чувствительный, причем этому определению не мешает присутствие химических реагентов. Кроме того, состав фракций можно определять с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.23] Параметры большинства белков вписываются в градуировочный график. Отклонения возможны в тех случаях, когда олигомер склонен к агрегации или диссоциации на мономеры или же не относится к глобулярным белкам [12]. Белки не должны сорбироваться в гранулах геля и порождать тем самым ложные зоны (пики), принимаемые за пизкомолекулярные примеси. Известно, что белки с высоким содержанием ароматических аминокислот или олигосахаридных цепей сорбируются на сефадексе. Потери белка на колонке по причине выпадения в осадок или сорбции можно оценить, сопоставляя суммарное содержание белка (по поглощению при 280 нм) в элюате и исходном образце, нанесенном на колонку. [c.24] Вернуться к основной статье