ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Методы разрушения клеток из "Руководство к практическим занятиям по микробиологии Изд.3" В большинстве экспериментов для выделения и определения внутриклеточных компонентов применяют различные методы разрушения микроорганизмов. Это могут быть ручные и механические гомогенизаторы, растирание клеток с абразивами, растирание замороженных клеток, перемешивание биомассы со стеклянными бусами. Наиболее полное разрушение клеток достигается в случае применения декомпрессионных методов (Х-пресс,Френч-пресс) или ультразвука. Реже применяют осмотический шок и метод замораживания-оттаивания. Описаны также комбинированные методы разрушения микроорганизмов, сочетающие обработку клеточных стенок ферментами с последующим осмотическим шоком полученных сферопластов (протопластов) или растиранием их в гомогенизаторе. [c.133] Отделенную от культуральной жидкости биомассу 2—3 раза промывают для удаления следов среды продуктов метаболизма, суспендируя каждый раз в свежей среде (обычно без источника углерода) или в буферном растворе. Экстракт, полученный после разрушения клеток, отделяют от неразрушенных клеток и крупных обломков центрифугированием с охлаждением от 10 мин при 15 тыс. до 1 ч при 40 тыс. ё в зависимости от целей эксперимента. Супернатант, называемый грубым, или исходным, экстрактом, можно затем повторно центрифугировать при 150—200 тыс. [c.133] Гомогенизацию можно использовать для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, не имеющих клеточной стенки или для животных и некоторых растительных клеток. Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3—5 объемов), переносят в ручной гомогени,затор и пропускают через него биомассу 10— 20 раз. При использовании механических гомогенизаторов с быстро вращающимися нОжами ( блендеров ) время обработки обычно не превышает 1—2 мин с интервалами по 20 с промежуточным охлаждением биомассы на льду. [c.134] Зазор между стеклянной стенкой и тефлоновым пестиком ручного гомогенизатора должен быть в пределах 0,35—0,70 мм. Механический гомогенизатор можно охлаждать в воде со льдом для поддержания низкой температуры при разрушении клеток (в этом случае резко снижается активность внутриклеточных протеиназ) или проводить эксперимент в холодной комнате. Степень разрушения контролируют в фазово -контрастном микроскопе или по белку, высвобожденному из клеток. [c.134] Одним из простых, но достаточно надежных способов разрушения клеток микроорганизмов является растирание их суспензий с абраз ивами. Для этой цели применяют промытый кварцевый песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия или другие твердые вещества. При разрушении к клеточной пасте постепенно добавляют двойное количество (по массе) абразива и растирают с силой до появления щелкающих звуков (обычно 10— 15 мйн после добавления последней порции абразива). В процессе растирания клеточная паста подвергается нагреву, поэтому дно ступки следует охлаждать (на лотке со льдом). [c.134] Особо следует отметить способ растирания клеток микроорганизмов, замороженных в жидком азоте, где в качестве разрушающего абразива выступают кристаллики льда, образовавшиеся при быстром замораживании биомассы (вкапывание суспензии в буфере в толстостенную ступку с налитым жидким азотом). При растираниях применяют обычно фарфоровые ступки и пестики. Время обработки зависит от толщины клеточных стенок разрушаемого микроорганизма. Этими способами можно растирать до 30 г сырых клеток за один прием. После растираний к полученной массе добавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, неразрушенных клеток и крупных их обломков. [c.134] Данный метод можно применять даже для разрушения клеточных стенок дрожжей, у которых она очень прочная, поскольку он основан на механическом растирании клеток, попадающих между двумя мелкими стеклянными шариками, вращающимися с большой скоростью в механических мельницах. Малые порции биомассы можно разрушать и в пробирке, используя пробирочный смеситель ( вортекс ). Для больших порций клеток необходимо применять специальные механические смесители ( мельницы ). [c.135] Отмытые клетки ресуспендируют в равном объеме буфера и помещают в прочную центрифужную пробирку с навинчивающейся пробкой для предотвращения вытекания жидкости при встряхивании. В пробирку добавляют 1—3 г охлажденных стеклянных шариков на каждый грамм клеточной массы и встряхивают на смесителе с максимальной скоростью 3—5 раз в течение 1 мин. В интервалах суспензию охлаждают на льду. Для микроколичеств применяют пробирки Эппендорф. [c.135] Стеклянные шарики перед опытом отмывают концентрированной соляной кислотой (или хромовой смесью), водопроводной, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции и высушивают в сушильном шкафу. К недостаткам метода относится сильный разогрев содержимого при встряхивании. [c.135] Ультразвук разрушает микроорганизмы в результате создания высокой степени вибрации и вследствие этого происходит механический разрыв клеток. Для достижения максимального эффекта необходимо применять высокую мощность излучателя и тщательно настраивать его в резонанс с пробой. Следует контролировать уровень пенообразования и перемешивания при обработке, поскольку интенсивное пенообразование приводит к денатурации белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жидкость/газ. Внутренние структуры клеток при этом также подвержены разрушению. [c.135] Кончик пестика излучателя должен быть опущен в обрабатываемую суспензию на глубину 1—2 см. Перед началом обработки излучатель должен быть настроен в резонанс цри выбранной мощности на порции подвергаемой обработке пробы или другой сходной по вязкости суспензии в сосуде, используемом для озвучивания. Обычно обработку проводят в пластиковых (полиэтиленовых) центрифужных стаканах, но можно использовать и стеклянные стаканы или стаканы из нержавеющей стали. Необходимым условием является строгий контроль за нагревом излучателя и температурой материала. Излучатель охлаждают холодной проточной водопроводной водой, а пробу — в воде со льдом. [c.135] Описанным методом можно разрушать как многие грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, но клетки актиномицетов, дрожжей и других грибов таким методом разрушаются с трудом. Иногда для усиления эффекта ультразвуковой обработки к суспензиям клеток добавляют кварцевый песок, стеклянные бусы малого диаметра или пудру окиси алюминия. [c.136] Ячейка Френч-пресса (Френч-пресс) предназначена для разрушения микроорганизмов, основанного на перепаде давления в пробе от высокого (550—1400 атм) к атмосферному. Быстрое изменение давления взрывает клетки изнутри и таким образом разрушает их. Метод наиболее применим к суспензиям объемами от 10 до 30 мл разрушение меньших объемов сложно технически, а больших—-занимает много времени. Время, требуемое для разру-шенця одной порции клеток небольшого объема, обычно не превышает 10—15 мин. В перерывах необходимо тщательно промывать ячейку от предыдущей пробы и постоянно контролировать состояние полиэтиленового шарика, регулирующего на ячейке степень перепада давления. [c.136] Перед разрушением клеточную пасту смешивают с буферным раствором в соотношении от 1 1 до 1 4 г/мл. Суспензию помещают в ячейку и ставят в гидравлический пресс под давление. Медленным откр1ываиием клапана устанавливают требуемую скорость вытекания разрушенного гомогената (обычно 1 капля/с). Для некоторых микроорганизмов необходима двойная или даже тройная обработка, чтобы достичь необходимую степень разрушения. Ячейку перед заполнением суспензией необходимо охлаждать в ледяной воде. Степень разрушения контролируют микроскопированием или по увеличению вязкости жидкости (в результате выхода ДНК). [c.136] Для получения сферопластов дрожжей суспензии их клеток могут быть подвергнуты лизису с помощью препарата ферментов, выделенных из содержимого желудка виноградной улитки. Такой улиточный фермент в течение короткого времени при 37—40° лизирует, например, клеточную стенку дрол жей рода Sa haromy es. Препарат фермента готовят и лаборатории из свежесобранных улиток и хранят в замороженном состоянии, используя по-потребности. [c.137] Лизирование клеток органическими растворителями обычно применяют для микроорганизмов, осажденных на фильтрах с целью проведения реакций с антителами или гибридизаций с пробами нуклеиновых кислот. Для проведения такой обработки чаще всего используют невысокие концентрации толуола (0,1—1,0%) в соответствующем буфере. [c.138] Этот метод применим для клеток с тонкой стенкой или лишенных ее, а также для лизирования протопластов и сферопластов микроорганизмов. Нагруженные высокой концентрацией соли или углеводов клетки подвергают ферментативному лизису в присутствии лизоцима и затем разводят в 10—50 раз дистиллированной водой. Действующие концентрации в значительной степени зависят от свойств исследуемого внутриклеточного фермента, вида микроорганизма, соединения, примененного для создания высокого осмотического давления внутри клеток и других факторов. [c.138] Этот метод (многократное замораживание, например, в ванне с Ж идким азотом, и оттаивание, например, в теплой воде) —быстрый, удобный, относительно дещевый — позволяет обрабатывать одновременно большое количество биомассы и дает легко воспроизводимые результаты, однако имеет свои ограничения. Клетки, разрушаемые таким способом, должны обладать не очень прочной стенкой или не содержать ее, а интересуемые внутриклеточные компоненты должны быть относительно стабильны к подобного рода обработке, не подвержены денатурации и защищены от протеолиза. [c.138] Вернуться к основной статье