Методы разрушения клеток

В общем наиболее распространенные физические методы разрушения клеток можно классифицировать следующим образом в порядке уменьшения их дезинтегрирующего действия пресс Хьюза > вибрационные мельницы>пресс Френча>ультразвук>растирание с окисью алюминия. По устойчивости к разрушению клетки различных микроорганизмов можно расположить в последовательности (в порядке уменьшения) дрожжи> >мицелий грибов>грамположительные кокки>грамположительные палочки>грамотрицательные палочки >галобактерии>-микоплазмы. [c.385]

МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК [c.138]

Выбор метода разрушения клеток является важнейшим моментом при построении схемы клеточного фракционирования. При выборе такого метода необходимо иметь в виду следующее. [c.138]

Методы разрушения клеток [c.68]

Большая часть белков и ферментов, изученных в ранний период истории белковой химии, была выделена из внеклеточных жидкостей. Причина этого заключается не только в легкости получения материала, но и в том, что внеклеточные белки в основном более стабильны часто благодаря наличию в них дисульфидных мостиков, а также небольшим размерам молекул. Первоначально исследования структуры белков, естественно, сосредоточивались на этих небольших белках. Так, лизоцим, рибонуклеаза и химотрипсин были самыми первыми детально изученными белками, и все они получены из внеклеточных источников. Однако большинство ферментов локализовано внутри клеток. Часто такие белки менее стабильны — у них обычно отсутствуют дисульфидные связи вследствие того, что внутриклеточная среда обладает восстанавливающими свойствами. Цель данного раздела — дать описание методов разрушения клеток и выделения ферментов в водный экстракт , что является первым этапом очистки ферментов. [c.39]

Изучение клеточной организации и попытки установить связь между структурой и функцией на различных иерархических уровнях — от простых молекул до макромолекул и таких агрегатов, как мембраны или частицы, до субклеточных единиц и, наконец, клеток — все это составляет одну из самых увлекательных и перспективных областей исследования в современной биологии. Для биохимика и цитолога выяснение химического значения различных сложных структурных элементов, обнаруженных в клетке, важно не только само по себе оно является необходимой ступенью любого исследования, направленного на то, чтобы понять, как происходит синтез, распад и взаимодействие этих элементов. Мы начинаем догадываться, что именно в этих сложных структурах скрыт секрет механизмов, с помощью которых осуществляется регуляция клеточных процессов как в пространстве, так и во времени. Этот секрет, возможно, заключается, по крайней мере отчасти, в том, что различные клеточные компоненты — главным образом ферменты, а также их субстраты и модификаторы (активаторы и ингибиторы) — находятся в разных отсеках клетки и потому не всегда доступны друг для друга. Из сказанного вытекает два вывода, подтвержденных в последнее время многочисленными экспериментальными данными 1) в клетке существует четкое распределение некоторых ключевых компонентов, особенно ферментов они локализуются в (или на) определенных клеточных структурах, представляющих собой микроскопические внутриклеточные органы, так называемых органеллах 2) эти структуры, а вместе с ними и соответствующие клеточные компоненты можно выделить с помощью подходящих мягких методов разрушения клеток (гомогенизация) и последующего фракционирования. [c.239]

Для разрушения клеток чаще всего применяют физические методы. Большинство животных клеток разрушается сравнительно легко, однако при разрушении растительных и бактериальных клеток зачастую приходится сталкиваться со значительными трудностями, связанными с наличием клеточных стенок. Физические методы разрушения клеток подразделяются в зависимости от того, происходит ли оно под действием сил трения между клетками и твердыми веществами (растирание клеток с твердыми материалами) или гидродинамически (разрушение клеток в жидких средах). [c.38]

Продавливание с помощью пресса представляет собой, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток. Некоторое количество бактериальной суспензии (объемом 5—40 мл с содержанием клеток до 30 об. %) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10-тонный гидравлический пресс. По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензии через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд преимуществ. Во-первых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5—10 °С, но эту жидкость можно быстро охлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню. Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы. В-третьих, при использовании гидравлического пресса удовлетворительного качества можно проводить эксперименты в хорошо вос- [c.140]

Схемы фракционирования на субклеточном уровне не могут быть универсальными, они обязательно должны быть индивидуальными. В них необходимо учитывать не только особенности отдельных организмов, но и тип органелл, которые выделяют, а также характер информации, которую требуется получить. Мы не будем здесь рассматривать все многочисленные схемы фракционирования, применяемые для бактерий и других микроорганизмов, а опишем лишь некоторые общепринятые методы разрушения клеток и фракционирования их содержимого, используемые для бактерий, и приведем несколько примеров применения этих методов к фракционированию кишечной палочки Es heri hia oli). [c.138]

Для получения мембран клетки сначала разрушают, используя один из следующих методов осмотический шок, растирание кусочков ткани с кварцевым песком или стеклянными шариками, размельчение гомогенизаторами различных типов. Метод разрушения клеток и длительность обработки выбирают в зависимости от типа ткани. Бактериальные протопласты и эритроциты обычно подвергают осмотическому шоку. Мягкие ткани (печень, мозг) разрушают с помощью гомогенизатора Поттера, более плотные (сердце, скелетные мышцы) — ножевым гомогенизатором, жабры рыб растирают с кварцевым песком. [c.64]

Соответствует ли метод разрушения клеток типу исследуемого организма Единой методики, которая давала бы хорошие результаты для всех типов бактерий, не существует. Например, один из возможных методов разрушения большинства грамотрицательных бактерий— продавливание клеток в прессе Френча — не очень эффективен по отношению к грамположительным коккам. Во встряхивающем гомогенизаторе Брауна полностью разрушаются клетки грамположительных кокков (Braun MSK shaker) и значительно повреждаются клетки грамотрицательных бактерий. [c.138]

Созревание аденовирусов происходит в ядрах зараженных клеток. Вирусы этой группы выходят в цитоплазму и культуральную среду, разрушая клетки. Таким образом, как правило, большая часть вируса (до 90%) ассоциирована с клеткой, и эффективность высвобождения вируса из ядерного и клеточного материала зависит от степени разрушения ядерных мембран. В клетках, зараженных вирусом, ядерные мембраны довольно хрупкие, поэтому на поздних стадиях инфекции вирус легко переходит в цитоплазму. Существует множество методов разрушения клеток. Выбор того или иного метода для каждого конкретного случая зависит от количества и природы клеток, подлежащих экстракции. Предлагаемый нами метод удобен для очистки аденовируса 5 типа [11]. [c.263]

На этом этапе можно считать, что найден удовлетворительный метод разрушения клеток и получен экстракт. Чтобы иметь воспроизводимые результаты, важно получать по возможности [c.46]

Существует множество методов разрушения клеток, что обусловлено разнообразием типов клеток. Большинство клеток имеют присущие только им особенности, которые следует учитывать при их разрушении. Животные ткани широко варьируют по своей прочности наряду с легко разрушаемыми эритроцитами используется и жесткий коллагенсодержащий материал, встречающийся в кровеносных сосудах и других тканях, содер- [c.39]

Гидродинамический сдвиг может быть использован для разрушения больших структур, даже целых клеток. Например, один из наиболее общих методов разрушения клеток состоит в том, что их подвергают действию интенсивных звуковых полей при этом обычно не принимают во внимание, что разрывы при озвучивании возникают за счет гидродинамического сдвига. Когда жидкость помещают в звуковое поле высокой интенсивности (либо помещая ее в объемный резонатор, либо, чаще, вводя в жидкость источник колебаний), в жидкости возникает кавитация, т. е. быстрое образование и схлопывание микропузырьков. Кавитация вызывается растворенными газами, выходящими в виде пузырьков из раствора. Интенсивное схлопывание этих пузырьков приводит к разрушению клеток, агрегатов молекул или макромолекул. (В чрезвычайно интенсивных звуковых полях некоторые химические соединения разрушаются, образуя свободные радикалы, которые могут быть причиной других повреждений молекул.) Не ясно, вызывает ли схлопывание пузырька турбулентность в жидкости или ее локальное ламинарное течение, но механизм разрушения, несомненно, связан с гидродинамическим сдвигом. Действительно, регулируя интенсивность звука, удавалось разрезать молекулы ДНК пополам, на четыре части и т. д. Контролируемое озвучивание редко используется в аналитических целях оно применяется главным образом для разрушения клеток, из которых затем извлекаются внутренние компоненты. В общем, методика проста, и единственная предосторожность, которую нужно соблюдать, — это избегать нагрева. При озвучивании воде [c.520]

Основным биологическим методом разрушения клеток микроорганизмов является лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для разрушения клеточных стенок грамотрицательных бактерий используют лизоцим и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), а клеточные стенки дрожжей гидролизуют с помощью одного или [c.365]

Еше один механический метод разрушения клеток — соударение. Клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность или навстречу потоку другой суспензии. В месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Таким способом с помощью устройства под названием Mi roflmdizer за один прием была разрушена большая часть клеток Е. соИ в двух встречных потоках суспензии. Однако для разрушения клеток других микроорганизмов может понадобиться большее число раундов. В отличие от гомогенизаторов под высоким давлением и высокоскоростных шаровых мельниц, в которых, как правило, используются концентрированные клеточные суспензии, данное устройство пригодно для обработки любых суспензий. Как показали предварительные исследования, активность клеточных белков уменьшается при разрушении клеток по этой методике лишь незначительно, А если обработать суспензию клеток небольшим количеством лизоцима, а затем использовать устройство Mi rofluidizer в режиме пониженного по сравнению с обычным давления и при небольшой вязкости, то сохранится активность некоторых лабильных белков, инактивирующихся при высоком давлении. [c.366]

Оптимальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из донорного штамма или трансфецирующей ДНК бактериального вируса часто зависит от особенностей соответствующих бактерий ил1/ вирусов. Общие принципы и методы разрушения клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий с целью выделения ДНК приведены в гл. 22. Чаще других для выделения и очистки высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов применяется метод, описанный Мармуром [29]. Он подробно изложен в разд. 22.2.1. Однако в большинстве случаев использование высокоочищенных препаратов ДНК, не содержащих РНК и другие примеси, необязательно поэтому можно обойтись без обработки рибонуклеазой. Специальные методы выделения ДНК плазмид описаны в гл. 15. [c.67]

Необходимо отметить, что получаемые при разрушении клеток мембранные фрагменты способны самопроизвольно образовывать замкнутые пузырьки — везикулы. К ним относят микросомы, субмитохондриальные частицы из внутренней митохондриальной мембраны, синаптосомы, образующиеся при отрыве нервных окончаний в области синаптических контактов. Скорость оседания таких частиц при центрифугировании определяется их размерами, зависящими от метода разрушения клеток и состава среды. Для сохранения замкнутости мембранных органелл используют среду, изоосмотичную их внутреннему содержимому (сорбитол, маннитол, сахарозу). [c.219]

Первым этапом по поиску продуцентов специфических эндонуклеаз является получение бесклеточных экстрактов исследуемых культур. Для разрушения клеток в таких опытах обычно используется их обработка ультразвуком [104, 246, 261]. Иногда ультразвуковой дезинтеграции предшествует обработка клеток лизоцимом [245] или лизостафином [258]. В литературе имеются сведения и о некоторых реже используемых для разрушения клеток в обсуждаемых экспериментах, приемах. Так, Смит с соавт. [251] продемонстрировали, что рестриктазы, локализованные в периплазматическом пространстве клеток, могут быть переведены в раствор в результате осмотического шока, и успешно использовали этот прием в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. Механическое разрушение клеток при помощи гомогенизатора Поттера было предложено Майером и Райхенбахом [179]. Эти исследователи сравнивали три различных метода разрушения клеток ультразвуковую дезинтеграцию, осмотический шок и механический. Оказалось, что наиболее эффективным приемом в отношении выхода рестриктаз является обработка клеток ультразвуком. Осмотический шок и применение гомогенизатора Поттера дали выход соответственно на 40—60% и 20—40% ниже. Оказалось, что осмотический шок высвобождает рестриктазы только из грамотрицательных бактерий. По мнению авторов, механическое разрушение дает вполне приемлемые для опытов по поиску продуцентов рестриктаз результаты. Этот способ является менее трудоемким по сравнению с другими апробированными методами. Он успешно [c.136]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология