ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Отделение осадков и нерастворимых веществ из "Методы очистки белков" Появление в лабораториях эффективных центрифуг с охлаждением дало возможность использовать более чистый и совершенный по сравнению с фильтрацией способ отделения белковых и других осадков, особенно при работе с малыми объемами. Однако бывают случаи, когда фильтрация предпочтительнее. При провйдении крупномасштабной работы центрифугирование больших объемов может потребовать применения нестандартного оборудования, например проточной насадки (адаптера) (рис. 1.1) во всяком случае, этот процесс может быть таким же длительным, как и фильтрация. С другой стороны, большинство биологических материалов дают обильные и рыхлые осадки, которые быстро закупоривают фильтры, так что вскоре после начала фильтрации скорость потока резко уменьшается и фильтрация почти прекращается даже при отсасывании. В этой ситуации необходимо заменить фильтрующий материал. В производственных условиях можно использовать специальные жесткие фильтры с автоматическим соскабливающим устройством для удаления слизистого осадка по мере его накопления, но такие системы обычно не применяются в лаборатории. [c.13] Для удаления комков, волос, грязи, нерастворимых солей, и т. д. используют фильтрацию через бумагу Whatman 54, причем эта процедура обязательно должна предшествовать работе на колонке. Перед нанесением белкового раствора на колонку можно провести также центрифугирование. [c.14] При очистке фермента оптимальным считают центрифугирование, при котором получают плотный осадок и прозрачную надосадочную жидкость для этого можно пойти на увеличение времени центрифугирования. Осадки, полученные высаливанием, изоэлектрическим осаждением, осаждением в органических растворителях и другими методами, описанными в гл. 3, обычно центрифугируют при 15 ООО в течение 110 мин или при 5000 г в течение 30 мин. Следует отметить, что при работе с малыми объемами центрифугирование при 5000 в течение 30 мин может дать удовлетворительные результаты, если расстояние от мениска до дна пробирки равно 5 см. При работе же с большими объемами, когда это расстояние может достигать 20 см, 30 мин иногда недостаточно. Выше указаны лишь приблизительные величины g, так как при данной скорости вращения д возрастает по мере оседания частиц. Однако, если говорить не о величине а о скорости вращения и, из уравнения (1.1) следует, что время осаждения зависит не от абсолютной длины пути осаждаемой частицы, а от логарифма соотношения Хь и Xt. Эта величина лишь незначительно варьирует в разных центрифугах. Поэтому центрифугирование при 5000 об/мин в течение 30 мин дает сходные результаты во всех центрифугах. [c.16] Грубые гомогенаты, содержащие органеллы или их фрагменты, можно фракционировать с помощью дифференциального центрифугирования, при котором величина возрастает на. каждой ступени, и это приводит к последовательному осаждению частиц с постепенно уменьшающейся величиной г (р—ро). Такое дифференциальное центрифугирование является первым этапом очистки органелл от различных тканей при условии, что нужный фермент находится не в растворимой фракции, а в ор-ганеллах. [c.17] Хотя небольшие пробирки можно уравновешивать по объему на глаз, объемы, превышающие 200 мл, следует взвешивать, чтобы избежать дисбаланса. Это относится, однако, только к тем случаям, когда в пробирках находится один и тот же раствор. Если же пробирку с образцом, содержащимся, например, в растворе сульфата аммония 80%-ного насыщения (плотность около 1,20), уравновешивают водой, то при этом потребуется очень большой объем воды (рис. 11.5). И это не совсем правильный способ уравновешивания, так как а) одинаковой должна быть инерция, а не масса раствора и б) по мере осаждения частиц в пробирке инерция возрастает. Лучше использовать две пробирки, заполненные менее чем наполовину (при условии, что пробирки сделаны из достаточно жесткого материала, выдерживающего заданную величину g), либо пробирки меньшего размера с адаптером, либо другой ротор. Центрифужные пробирки из полипропилена или поликарбоната достаточно прочны и могут быть использованы для разных целей. В некоторых случаях нужны стеклянные центрифужные пробирки, но пробирки из обычного стекла (Ругех) выдерживают только 3000—4000 f специальные пробирки из прочного стекла (Со-гех) выдерживают до 15 000 g . [c.18] Вернуться к основной статье