ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Разрушение клеток и экстракция из "Методы очистки белков" Большая часть белков и ферментов, изученных в ранний период истории белковой химии, была выделена из внеклеточных жидкостей. Причина этого заключается не только в легкости получения материала, но и в том, что внеклеточные белки в основном более стабильны часто благодаря наличию в них дисульфидных мостиков, а также небольшим размерам молекул. Первоначально исследования структуры белков, естественно, сосредоточивались на этих небольших белках. Так, лизоцим, рибонуклеаза и химотрипсин были самыми первыми детально изученными белками, и все они получены из внеклеточных источников. Однако большинство ферментов локализовано внутри клеток. Часто такие белки менее стабильны — у них обычно отсутствуют дисульфидные связи вследствие того, что внутриклеточная среда обладает восстанавливающими свойствами. Цель данного раздела — дать описание методов разрушения клеток и выделения ферментов в водный экстракт , что является первым этапом очистки ферментов. [c.39] Оборудование, используемое для разрушения клеток при получении экстракта. Л. Ручной или механический стеклянный гомогенизатор. Б. Лопастной смеситель (бытовой миксер). В. Ультразвуковой гомогенизатор. Г, Вибрационная шаровая мельница. Д. Клеточный дезинтегратор Мэитона — Гаулина. [c.41] Эти методы служат для разрушения клеток и выделения ферментов в раствор. Если фермент локализован в органеллах, метод может быть использован только при условии, что органеллы также разрушаются. С другой стороны, может понадобиться предварительное выделение самих органелл, что позволит избавиться от загрязнения цитоплазматическими ферментами перед экстракцией фермента из органелл. Для этого требуется менее сильное воздействие. Предварительное растворение поверхностных коллагеновых и целлюлозных структур препаратами гидролитических ферментов позволяет в дальнейшем разрушать клетки более мягкими способами, сохраняя целостность органелл. Примером подобной методики служит получение препаратов митохондрий из таких тканей, как скелетная или сердечная мышцы, под действием протеолитических ферментов [6]. Однако эта методика применима только для получения препаратов в небольших масштабах и больше подходит для. метаболических исследований органелл, чем для очистки ферментов. Выход очищенных органелл может быть очень низким, поэтому во многих случаях лучше сначала разрушить всю ткань, а затем уже приступить к выделению нужного фермента из сложной смеси белков в экстракте. Таким образом, ферменты митохондрий и хлоропластов часто получают из тканевого гомогената, а не из выделенных органелл. [c.42] Наконец, фермент может быть нерастворим в буфере, используемом для экстракции. В этом случае необходим специальный подход, который кратко рассматривается в разд. 2.4. [c.42] Растительные ткани значительно отличаются от животных. Как указывалось в предыдущем разделе, внутриклеточное содержимое составляет лишь малую часть объема растительной ткани. Наличие больших вакуолей (рассматриваемых здесь как внеклеточные образования) и межклетников служит причиной высвобождения большого количества жидкости при разрушении ткани. В этом случае практически не требуется добавления экстрагирующей жидкости. Объем осадка после центрифугирования может составлять только 20—40% объема исходной растительной ткани. Тем не менее использование дополнительного экстрагирующего раствора может быть очень важно для контролирования нежелательных процессов, происходящих во время гомогенизации. Такими процессами могут быть подкисление среды или окисление нестойких соединений. Особую проблему представляют растения, содержащие фенольные соединения, которые окисляются в основном под действием эндогенных фено-локсидаз с образованием темных пигментов. Эти пигменты ковалентно соединяются с белками и инактивируют многие ферменты. Пригодны два способа решения этой проблемы. Во-первых, добавление какого-либо тиолового соединения, например р-меркаптоэтанола, сводящего до минимума действие фенол-оксидаз. Во-вторых, часто оказывается полезным добавление порошкообразного поливинилпирролидона, адсорбирующего фенольные соединения. [c.43] По объему осадка, получаемому после центрифугирования, микроорганизмы больше похожи на животные ткани. Дрожжи и сходные с ними грибы с толстой клеточной стенкой дают осадок, объем которого практически равен исходному объему клеточного материала. То же самое характерно и для бактерий. Если в процессе экстракции действуют значительные силы сдвига, в раствор может перейти большое количество материала клеточной стенки. Это создает новые проблемы, которые будут обсуждаться далее (разд. 2.3). [c.43] Далее в общих чертах описываются процедуры получения экстрактов из различных тканей. [c.44] Экстракт можно легко получить из осажденных центрифугированием эритроцитов после промывания их изотоническим раствором Na l (0,9%, 0,15 М) и повторного центрифугирования. Клетки разрушают осмотическим шоком в воде (2 объема воды на 1 объем отцентрифугированных клеток). Однако около 90% белка, переходящего в раствор, составляет гемоглобин, и если вы занимаетесь очисткой другого белка, то очень полезно применить метод селективного удаления гемоглобина. Для денатурации гемоглобина успешно применяется смесь этанол-хлороформ [7]. [c.44] Здесь приведено лишь несколько примеров процедур, используемых для получения экстрактов из различных источников. На практике чаще пользуются опубликованной методикой, но следует помнить, что применяемое сырье так же, как и оборудование, может значительно отличаться от описанных в методике, поэтому иногда возникает необходимость приспособить метод к определенным условиям. [c.46] Таким образом, в основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в соответствующем буфере с последующим центрифугированием смеси для удаления нерастворимых остатков. [c.46] В следующем разделе описано, как можно улучшить качество экстракта, служащего исходным материалом для очистки фермента. [c.46] Вернуться к основной статье