Разрушение клеток и экстракция

Разрушение клеток и экстракция. Растительные клетки разрушаются труднее, чем клетки животных, из-за наличия у них целлюлозной оболочки. При их разрушении применяют следуюш ие методы механическое разрушение крупных клеток и отделение друг от друга мелких с помош ью лопастного гомогенизатора растирание в ступке с абразивом (происходит разрушение клеточных стенок за счет шероховатостей на ступке и пестике) использование пресса Френча (клетки продавливаются через маленькие отверстия под давлением). [c.50]

Эти методы служат для разрушения клеток и выделения ферментов в раствор. Если фермент локализован в органеллах, метод может быть использован только при условии, что органеллы также разрушаются. С другой стороны, может понадобиться предварительное выделение самих органелл, что позволит избавиться от загрязнения цитоплазматическими ферментами перед экстракцией фермента из органелл. Для этого требуется менее сильное воздействие. Предварительное растворение поверхностных коллагеновых и целлюлозных структур препаратами гидролитических ферментов позволяет в дальнейшем разрушать клетки более мягкими способами, сохраняя целостность органелл. Примером подобной методики служит получение препаратов митохондрий из таких тканей, как скелетная или сердечная мышцы, под действием протеолитических ферментов [6]. Однако эта методика применима только для получения препаратов в небольших масштабах и больше подходит для. метаболических исследований органелл, чем для очистки ферментов. Выход очищенных органелл может быть очень низким, поэтому во многих случаях лучше сначала разрушить всю ткань, а затем уже приступить к выделению нужного фермента из сложной смеси белков в экстракте. Таким образом, ферменты митохондрий и хлоропластов часто получают из тканевого гомогената, а не из выделенных органелл. [c.42]

Созревание аденовирусов происходит в ядрах зараженных клеток. Вирусы этой группы выходят в цитоплазму и культуральную среду, разрушая клетки. Таким образом, как правило, большая часть вируса (до 90%) ассоциирована с клеткой, и эффективность высвобождения вируса из ядерного и клеточного материала зависит от степени разрушения ядерных мембран. В клетках, зараженных вирусом, ядерные мембраны довольно хрупкие, поэтому на поздних стадиях инфекции вирус легко переходит в цитоплазму. Существует множество методов разрушения клеток. Выбор того или иного метода для каждого конкретного случая зависит от количества и природы клеток, подлежащих экстракции. Предлагаемый нами метод удобен для очистки аденовируса 5 типа [11]. [c.263]

Резервные полисахариды микроорганизмов являются обычно глюканами типа гликогена. Для их выделения клетки микроорганизма после механического разрушения подвергают экстракции щелочью или водой. [c.545]

Необходимая стадия прн выделении большинства Б.— механич, разрушение клеток и экстракция требуемого Б. Иногда экстракции предшествует фракционирование содержимого клетки но субклеточным фракциям с помощью препаративного ультрацентрифугиро-вания. Известны также методики выделения, согласно к-рым механич. разрушения клеток не происходит. Такие методики применяют обычно для выделения внеклеточных Б. (напр., протеолитич. ферментов, гормонов, белков, гликопротеидов и липопротеидов плазмы крови, гликопротеидов соединительной ткани). Именно этот класс Б. наиболее доступен. [c.129]

Источником получения ДНК обычно является ви-лочковая железа (тимус) телят, т. к. в ее клетках ядра составляют больше половины объема. Для получения РНК удобнее всего использовать дрожжи. Н. к. всегда тесно связаны с белками в нуклеопротеидных структурах. Для их освобождения проводят денатурацию белков добавлением к взвеси клеток (предварительно вскрытых путем разрушения их оболочки ) р-ра фенола высокой концентрации, а также нек-рых детергентов (напр., додецилсульфата) или хлороформа. Обычно фенольная депротеинизация ведется так, что фенола дается большой избыток и после отстаивания или центрифугирования образуются два слоя внизу — фенол, насыщенный водой, сверху — вода, насыщенная фенолом. Денатурированные белки сосредоточиваются в нижнем слое и у границы раздела, Н. к.— в верхнем водном слое, откуда их осаждают спиртом. При фенольной экстракции возможно частичное фракционирование Н. к. на ДНК (растворяется преимущественно при pH9) и РНК (растворима и при рН5). Однако полностью отделить ДНК и РНК друг от друга удается только дополнительным воздействием специфическими гидролитич. ферментами ДНК-азой и РНК-азой. Эти ферменты добьхваются из поджелудочной железы рогатого скота, подвергаются тщательной очистке и кристаллизации. Действуя ДНК-азой, разрушают ДНК и получают чистую РНК. С помощью РНК-азы очищают ДНК от РНК. После ферментативной обработки полученные продукты снова подвергают фенольной депротеинизации с последующим осаждением Н. к. спиртом. [c.189]

Экстракция растворимых белков из тканей может происходить только после разрушения клеточных оболочек, так как последние непроницаемы для больших белковых молекул. Разрушения клеток можно достичь механическим путем, растирая их с песком или с кизельгуром однако при этом наблюдается некоторая потеря белка за счет денатурации, вызываемой адсорбцией белка на силикате. По этой причине лучше разрушать клетки такими приборами, как мясорубка Латапи или гомогенизаторы. Структура клетки разрушается также при действии органических растворителей, например спирта, ацетона или глицерина. Если концентрация глицерина не превышает 85%, то в глицериновый экстракт переходит значительная часть растворимого белка. Этим способом можно экстрагировать гидролитические ферменты из поджелудочной железы и из других органов. Глицериновые экстракты при комнатной температуре относительно стабильны. Повидимому, рыхлая ассоциация белка с полярными гидроксильными группами глицерина уменьшает скорость его денатурации. Однако эти же полярные группы в молекуле глицерина обусловливают взаимное притяжение его молекул и высокую вязкость этого растворителя. Из глицериновых экстрактов очень трудно поэтому получить чистые препараты белков. В связи с этим глицерин в настоящее время редко применяется для разрушения клеточных оболочек. Вильштеттер и его сотрудники для разрушения клеток пользовались ацетоном. Этот метод основан на том, что многие белки при концентрации ацетона выше 80—90% денатурируются очень медленно. Для экстракции размельченный или пропущенный через мясорубку орган помещают в ацетон. Преимущество этой процедуры заключается в том, что ацетон не только разрушает клеточные оболочки, но одновременно экстрагирует из клеток и большинство липидов. Липиды можно затем удалить количественно при последующей обработке эфиром. Остаток после удаления липидов высушивается на листе фильтровальной бумаги и экстрагируется водой, разведенными растворами солей или буферов. Хотя большинство белков, в том числе много важных ферментов, можно получить из ацетоновых вытяжек в нативном состоянии, однако надо помнить, что некоторые лабильные белки при действии этого растворителя денатурируются. [c.10]

Клетки собирают центрифугированием при 5000— 10 000 д в течение 15 мин, ресуспендируют в равном объеме физиологического раствора и снова центрифугируют. Еще раз промывают клетки, центрифугируют и лиофилизуют их (разд. 12.2.1). 100 мг сухих клеток помещают в пирексовую или кимаксовую пробирку, имеющую завинчивающуюся крышку с тефлоновой прокладкой, вносят в нее 1 мл 30%-ного КОН и инкубируют в паровой или кипящей бане в течение 3 ч при 100 °С. Если лиофилизация нецелесообразна, суспендируют 500 мг сырых клеток в 0,6 мл 50%-ного (вес/объем) КОН и нагревают при 100°С для солюбилизации гликогена. Охлаждают пробирку, не открывая ее. После охлаждения добавляют 3 мл дистиллированной воды и 8 мл этанола для осаждения гликогена. Центрифугируют при 10 000 д в течение 15 мин и осадок промывают 8 мл 60%-ного охлажденного этанола путем центрифугирования. Высушивают осадок в вакуумном эксикаторе. В промытом осадке можно определить глюкозу антроновым или фенольным методом (разд. 17.2.1 и 17.2.2). Можно также провести гидролиз для получения глюкозы и дальнейшего ее определения по глюкозооксидазной методике (разд. 17.2.3). Для полной экстракции гликогена из грамположительных клеток иногда требуется их механическое разрушение [9]. [c.299]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология