ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Выделение белков из "Основы биохимии" Впервые белок (клейковина) был вьщелен Я. Беккари из пшеничной муки в 1728 г. Эту дату принято считать годом зарождения химии белка. В 1762 г. началась работа по изучению белка молока—казеина (А. Халлер), затем с 1789 г.—белков крови (А. Фуркруа). За два с половиной столетия из природных источников получены сотни различных белков и изучены их свойства. [c.24] Для успешного выделения белка из биологического объекта необходимо тончайшее измельчение тканей вплоть до разрушения клеточных стенок. Для этого используют (рис. 6) специальные валковые (А) или шаровые (J ) мельницы, в которых исходный материал многократно продавливается меж тесно сближенными валками или расплющивается непрерьгено сталкивающимися шарами. С этой же целью широко применяют гомогенизаторы (В и Г), в которых материал либо измельчается острыми ножами, вращающимися с огромной скоростью (12000 об/мин и более), либо растирается между пришлифованными стенками стеклянных пробирки и пестика, либо в замороженном состоянии продавливается через фильеры специального пресса (Д). [c.24] Хорошие результаты дает метод разрушения клеточных оболочек путем попеременного замораживания и оттаивания ткани. Роль рабочего инструмента вьшолняют здесь кристаллики льда, разрывающие стенки клеток и освобождающие клеточное содержимое. Применяют также метод азотной бомбы , заключающийся в насьпцении суспендированных клеток газообразным азотом под высоким давлением, которое затем резко сбрасывают,— азот, проникший внутрь клеток, вьщеляется в виде газа и взрьгеает их. [c.24] Кпассификация методов разрушения (дезинтеграции) биологического материала, отражающая разнообразие подходов, используемых с этой целью при вьщелении белков и других соединений из природных объектов, приведена в табл. 2. [c.24] Таким образом, максимальным растворяющим действием должен обладать пирофосфат литая, минимальным—хлорид натрия. [c.26] Хорошие результаты дает извлечение белков спирто-солевыми смесями. Металлопротеины, образующиеся при этом, обладают разной растворимостью в спирте, что позволяет извлекать индивидуальные белки при различной концентрации спирта. Весьма широко применяют для экстракции белков глицерин, предохраняющий их от денатурации. [c.26] Перечисленные детергенты ослабляют гидрофобные белково-липидные и белок-белковые взаимодействия, результатом чего являются деструкция биологических мембран и высвобождение из них структурных и функциональных белковых компонентов. [c.26] Сказанное вьшхе о выделении белков в основном относится к животным тканям. Выделение белков из растительного материала неизмеримо труднее здесь сложнее разрушить стенку клеток, более вероятна денатурация белков за счет их взаимодействия с дубильными веществами и т. п. Поэтому при вьщелении белков из вегетативных органов растений используют специфические приемы обработку тканей водно-эфирной смесью, резко повышающей проницаемость оболочки растительной клетки (метод Чибнелла), экстракцию белков смесью фенола, уксусной кислоты и воды (метод Синджа) и др. [c.26] Из органических растворителей для фракционирования белков широко применяют метиловый и этиловый спирты (во избежание денатурации белка процесс ведут при температуре около 5° С). В этих случаях также предварительно строят разностные диаграммы. На рис. 8 приведены данные о концентрациях этилового спирта при осаждении разных фракций белков сыворотки крови человека. Этот метод нашел широкое применение при выработке заменителей крови, так как позволяет извлекать из нее необходимые ингредиенты и длительно сохранять их. При фракционировании белков иногда сочетают высаливание и осаждение спиртом, применяя спиртосолевые растворы. [c.27] Метод осаждения ионами тяжелых металлов находит ограниченное применение при фракционировании белков и осуществляется в большинстве случаев в сочетании с другими методами фракционирования (высаливание, осаждение органическими растворителями). Метод основан на взаимодействии ионов Hg, 2п, Са, Ва, РЬ, Ре, Си, и и других тяжелых металлов с реакционноспособными аминокислотными радикалами белковой молекулы (Hg —с сульфгидриль-ными группами, —с имидазольными, Са и Ва —с радикалами фосфосерина и т. п.). [c.27] Метод электрофореза основан на способности различных белков перемещаться под Действием электрического поля с неодинаковой скоростью (а иногда и в противоположных направлениях) в растворе, на влажной фильтровальной бумаге или в другой твердой опорной среде. Напряжение при этом устанавливают от нескольких сотен до нескольких тысяч вольт, силу тока—в несколько десятков миллиампер. Скорость передвижения белковых молекул определенного вида к аноду или катоду является функщ1ей электрического заряда, молекулярной массы и формы молекул, ионной силы, pH и состава буферного раствора, а также приложенных потенциалов. Сочетание перечисленных факторов всегда специфично для каждого индивидуального белка, и естественно, что разные белки обладают различной электрофоретической подвижностью. [c.28] Однако в 100—200 раз чувствительнее реакция обнаружения белков посредством окрашивания их в гелях аммиачными комплексами серебра. [c.28] Одной из ее модификаций является хроматография, основанная на гидрофобном взаимодействии носителя (фенил- или октилсефароза) с соответствующими неполярными аминокислотными радикалами белковых молекул. Применение эффективных сорбентов (различные производные силикагеля) и высокого давления при элюировании с них белков привело к возникновению ряда вариантов жидкостной хроматографии высокого разрешения. [c.30] Механизм ионообменной хроматографии белков представлен на рис. 10. [c.30] Для элюции адсорбированных белков с колонки используют солевые растворы, имеющие различные концентрации и значения pH. Если изменение концентрации солевого раствора осуществляется в процессе снятия белков с одной и той же колонки, такую элюцию называют градиентной. Элюат собирают небольшими порциями (по несколько миллилитров) в отдельные пробирки при помощи специальной установки—коллектора (сборщика) фракций. Таких проб в процессе фракционирования белков на колонке хроматографическим методом получают обычно несколько сотен. В результате проведения цветной реакции на белок или путем измерения поглощения каждого раствора в ультрафиолетовой области спектра устанавливают содержание белка в каждой пробе. По этим данным строят кривую, из рассмотрения которой становится ясным, сколько фракций белка содержится в элюате и в какой серии пробирок находится каждая фракция. Одноименные пробы объединяют и из полученного раствора выделяют чистый белок. [c.30] Аналогично этому обработка другого полисахарида—агарозы 2,3-ди-бром-пропанолом в резко щелочных условиях приводит к возникновению сетчатого полимера сефарозы, дающего гели, пригодные для фракционирования белков с молекулярными массами в сотни тысяч дальтон. [c.31] В зависимости от числа поперечных связей в сефадексе и размера белковых молекул осуществляется та или иная степень проникновения последних внутрь гранул сефадекса, заполняющих колонку. Большие белковые молекулы, не способные пройти через сито из ячеек в гранулу, быстро выносятся из колонки с током элюента мелкие молекулы белка, проникшие внутрь зерна сефадекса, удерживаются некоторое время последним и выходят из колонки с последующими порциями элюата. Таким образом, колонка с сефадексом как бы просеивает через себя молекулы белка по их размерам, выпуская, как это ни парадоксально, первыми самые крупные молекулы (рис. 11). Так как гранулы сефадекса сильно разбухают в растворителе и образуют гель, этот метод называют также методом гельфильтрации. [c.31] Вернуться к основной статье