ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры из "Секвенирование ДНК" В настоящее время перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры преследует обычно несколько иные цели, чем тогда, когда этот метод только разрабатывался. Так, в большинстве случаев перенос ДНК из геля на фильтры осуществляется для последующей визуализации полос ДНК с помощью нерадиоактивной колориметрической или хемилюминесцентной детекции, описанной выше в разделе 2.6, Причем вкупе с мультиплексным секвенированием возможно последовательное многократное проведение этапов молекулярной гибридизации с определенным зондом, несущим ту или иную метку визуализация Д1Ж зонда после ее гибридизации с ДНК, находящейся на фильтре удаление зонда и проведение аналогичных этапов со следующим зондом, С фрагментами ДНК, находящимися в полиакриламидном геле, проведение подобных процедур принципиально невозможно и поэтому перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры занимает важное место в арсенале современной молекулярной биологии. [c.186] Предложенный в 1984 г. метод геномного секвенирования был основан на выявлении определенных последовательностей ДНК путем их гибридизации с меченным зондом [ hur h, Gilbert, 1984]. Для осуществления такой гибридизации была необходима процедура переноса фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на нейлоновый фильтр. Перенос даже небольших фрагментов ДНК из полиакриламидного геля на мембранные фильтры за счет капиллярных сил малоэффективен и поэтому в данной работе, учитывая большие размеры геля, была сконструирована специальная камера для электропереноса. [c.186] Попутно следует отметить, что несмотря на то, что перенос ДНК из секвенирующего геля путем прямого блоттирования имеет главной целью возможность нерадиоактивной детекции полос ДНК, тем не менее нет каких-либо препятствий для разделения радиоактивно меченных фрагментов ДНК и последующей радиоавтографии уже не геля, а самой нейлоновой мембраны на рентгеновскую пленку. Более того, четкость полос на радиоавтографе обычно бывает значительно выше ввиду того, что радиоактивная ДНК находится на поверхности самой мембраны, а не в толще геля как при обычной радиоавтографии и, таким образом, не происходит дополнительного рассеяния Р-частиц. Единственное, за чем необходимо следить экспериментатору, так это, чтобы к рентгеновской пленке была обращена именно та сторона мембраны, на которой и сорбирована ДНК, в противном случае четкость полос будет заметно хуже. [c.187] Вернуться к основной статье