Перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры

В настоящее время перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры преследует обычно несколько иные цели, чем тогда, когда этот метод только разрабатывался. Так, в большинстве случаев перенос ДНК из геля на фильтры осуществляется для последующей визуализации полос ДНК с помощью нерадиоактивной колориметрической или хемилюминесцентной детекции, описанной выше в разделе 2.6, Причем вкупе с мультиплексным секвенированием возможно последовательное многократное проведение этапов молекулярной гибридизации с определенным зондом, несущим ту или иную метку визуализация Д1Ж зонда после ее гибридизации с ДНК, находящейся на фильтре удаление зонда и проведение аналогичных этапов со следующим зондом, С фрагментами ДНК, находящимися в полиакриламидном геле, проведение подобных процедур принципиально невозможно и поэтому перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры занимает важное место в арсенале современной молекулярной биологии. [c.186]

Желание экспериментаторов хоть как-то оградить себя от вредного воздействия радиоактивности повлекло за собой выявление полос ДНК как колориметрическими, так и хемилюминесцентными методами. Однако эффективное проведение таких реакций возможно только с фрагментами ДНК, сорбированными на поверхности какого-нибудь твердого носителя, а не находящимися внутри полиакриламидного геля. Чисто технические трудности переноса фрагментов ДНК из секвенирующего полиакриламидного геля на нейлоновые, нитроцеллюлозные или какие-то другие мембранные фильтры заметно сдерживали развитие этого подхода. Разработка специальных приборов для секвенирующего электрофореза с одновременным переносом выходящих фрагментов ДНК из нижнего среза геля на находящийся в соприкосновении с ним движущийся мембранный фильтр заметно упростила процедуру переноса (более подробно такие приборы вместе с особенностями переноса фрагментов ДНК, а также другие способы переноса рассмотрены в главе, посвященной электрофоретическому разделению секвенируемых фрагментов ДНК). [c.105]

ПЕРЕНОС ФРАГМЕНТОВ ДНК ИЗ СЕКВЕНИРУЮЩЕГО ГЕЛЯ НА МЕМБРАННЫЕ ФИЛЬТРЫ [c.186]

Предложенный в 1984 г. метод геномного секвенирования был основан на выявлении определенных последовательностей ДНК путем их гибридизации с меченным зондом [ hur h, Gilbert, 1984]. Для осуществления такой гибридизации была необходима процедура переноса фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на нейлоновый фильтр. Перенос даже небольших фрагментов ДНК из полиакриламидного геля на мембранные фильтры за счет капиллярных сил малоэффективен и поэтому в данной работе, учитывая большие размеры геля, была сконструирована специальная камера для электропереноса. [c.186]

Следует отметить, что необходимым условием осуществления мультиплексного секвенирования ДНК является перенос фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на мембранный фильтр, поскольку проведение всех этих последовательных процедур гибридизации, окрашивания, отмывки возможно только с мембранным фильтром. Второе условие заключается в прочной сорбции фрагментов ДНК на данном фильтре, выдерживающей многократные инкубации в различных растворах. В противном случае мультиплексное секвенирование будет просто невозможно. Немаловажное значение имеет тип используемой метки. Так, при использовании радиоактивной метки процесс выявления последовательностей всех матриц ДНК довольно продолжителен ввиду требующейся длительной экспозиции фильтра на рентгеновскую пленку, занимающей иногда несколько суток. Гораздо быстрее результаты могут быть получены с помощью хемилюминесценции такого субстрата, как 1,2-диоксетан. Считается, что каждый цикл мультиплексного секвенирования с его использованием требует 1 ч на гибридизацию с меченой пробой и 1,5 ч на все процедуры по выявлению гибридизационных сигналов [ reasey et al., 1991]. [c.299]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология