ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Стабильность плазмид в клетках из "Генетическая инженерия" Возможен и другой подход к оптимизации экспрессии чужеродных генов в клетках В. subtilis. Изучаемый структурный ген соединяют с синтетическим сегментом ДНК, кодирующим участок связывания рибосом, специфичный для бацилл. Такую конструкцию затем можно помещать под контроль разнообразных промоторов. В частности, используя различные синтетические сегменты ДНК, содержащие SD-последо-вательности, Дж. Флок с соавторами (1984 г.) получили гибридные плазмиды, которые в клетках В. subtilis направляли синтез поли-пептидного гормона человека урогастрона в свободном виде. Данный прием является достаточно общим и может быть использован при клонировании в клетках бацилл любых генов. [c.267] Бациллы имеют сложный цикл дифференцировки, и у них существуют гены, функционирующие на определенных стадиях клеточного развития. Поэтому можно применять промоторы, которые будут включать экспрессию чужеродного гена в желаемой экспериментатору фазе клеточного цикла. [c.267] При конструировании гибридных генов кодирующую последовательность можно помещать под контроль тандемно повторенных промоторов. Это, как правило, приводит к увеличению эффективности транскрипции изучаемого гена. Собирая блоки из двух-трех различных промоторов с разной системой репрессии-индукции, можно гибко регулировать экспрессию целевого гена и обеспечивать сверхсинтез кодируемого им белка. [c.267] Особое значение для генно-инженерной системы бацилл имеет получение мутантов бактерий со сниженной активностью протеаз, и прежде всего экзопротеаз. Для многих чужеродных белков только использование мутантов В. subtilis, дефектных по протеазам, позволяет обеспечить высокий уровень их внеклеточной продукции. [c.267] Разработка методологии клонирования генов в клетках В. subtilis вывела на качественно новый уровень молекулярно-генетические исследования данной грамположительной бактерии. В клетках В. subtilis в составе фаговых или плазмидных ДНК клонирован широкий спектр хромосомных генов бацилл, в том числе spo-гены, участвующие в регуляции спорообразования, гены а-амилаз, пенициллиназ, протеаз. При этом, как уже отмечалось, за счет повышенной дозы гена в клетках, содержащих гибридные плазмиды, обычно наблюдается сверхсинтез соответствующих продуктов. [c.267] Нестабильность структуры гибридных плазмид иногда может быть обусловлена влиянием на них клонированного репликатора или сильного промотора. В результате рекомбинационных событий in vivo спонтанно образуются стабильные варианты плазмид, у которых интерференция чужеродной ДНК преодолевается. Такие плазмиды чаще всего являются делеционными производными исходных гибридных молекул ДНК. Повторяющиеся последовательности, которые могут возникать в гибридных плазмидах, также обусловливают нестабильность их структуры. [c.268] При работе с бифункциональными векторами может возникать ситуация, когда размноженные в Е. oli гибридные молекулы ДНК будут подвергаться атаке системой рестрикции В. subtilis, что приведет к снижению уровня плазмидной трансформации бацилл и появлению делеционных вариантов плазмид. В таких случаях необходимо использовать штаммы Ba illus, мутантные по системе рестрикции. [c.268] ИСХОДИТ обогащение популяции бесплазмидными клетками и постепенная, иногда очень быстрая, утрата плазмиды бактериальной культурой. [c.269] Биотехнология Учеб. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 2. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов / В. Г. Дебабов, В. А. Лившиц. М. Высш. шк., 1988. 208 с. [c.269] Щелкунов С. Н. Клонирование генов. Новосибирск Наука, 1986. 228 с. [c.269] Как видим, поведение гибридных плазмид в клетках В. subtilis во многом подчиняется тем же законам, что ивЕ. соИ. [c.269] Необходимо отметить, что используемые подходы базируются прежде всего на том большом опыте, который бьш накоплен в ходе генно-инженерных исследований на Е. соН и В. subtilis. [c.271] Методология рекомбинации молекул ДНК in vitro универсальна. Поэтому возможность проведения генно-инженерных экспериментов на выбранном виде бактерий определяется способностью клеток к генетической трансформации и наличием векторных молекул. [c.271] Вернуться к основной статье