Стабильность плазмид в клетках

Знание полной структуры par привело к заключению, что путем встройки всего локуса в состав нестабильно поддерживаемых плазмид можно добиться существенно большего повышения стабильности в клетках Е. соИ, чем при встройке только i/мс-действующего элемента. Данное предположение подтвердилось в эксперименте показано, что введение полного локуса par снижает скорость утраты клетками плазмид по крайней мере в 100 раз по сравнению с его индивидуальным г/мс-действующим элементом. [c.205]

Японские исследователи подробно изучили влияние повторов средней длины на стабильность плазмид в клетках Е. соИ. Оказалось, что состыкованные инвертированные повторы длиной 100-150 пн могут сохраняться в составе плазмид, реплицирующихся в клетках Е. соН [c.209]

Многие мелкие репликоны используют альтернативную стратегию стабильного наследования. Они, по-видимому, не имеют механизма упорядоченной сегрегации, но поддерживаются в высоком числе копий. Высокая копийность обеспечивает относительно стабильное наследование репликона при случайном распределении молекул по дочерним клеткам при делении. Вероятность того, что репликон при таком способе распределения будет утерян (т. е. в одну из дочерних клеток не попадет ни одной копии ДНК данного репликона), равна (1/2) , где п — число копий, т. е. меньше 0,1 % уже для 10 копий плазмиды в клетке. Естественно, для этого способа принципиально важным является строгое восстановление копийности, чтобы единственная молекула ДНК успела быстро размножиться до характерного для нее числа копий до начала следую-ш,его деления клетки. [c.69]

Т-ДНК (T-DNA) Фрагмент Ti-плазмиды, который встраивается в ядерную ДНК клетки-хозяина и стабильно наследуется ею. Вызывает образование опухоли у растений (корончатого галла). [c.561]

Другой тип существования в бактериальной клетке представлен плазмидами. Это автономные элементы, геномы которых существуют в клетке как внехромосомные единицы. Плазмиды-это самореплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК, которые сохраняются в клетке стабильно и в характерном для каждого типа плазмид числе копий иными словами, число их остается постоянным из поколения в поколение. [c.206]

Для изучения данной функции на молекулярном уровне и на этот раз были использованы дрожжи. Все плазмиды, выживающие в дрожжевых клетках, являются кольцевыми молекулами ДНК. Линейные плазмиды нестабильны (поскольку они деградируют). Могут ли аутентичные теломерные последовательности ДНК придавать стабильность линейной плазмиде [c.354]

Открытию транспозиции и других перестроек в ДНК в какой-то мере способствовали наши знания об удивительной способности последовательностей ДНК приспосабливаться. Чужеродную ДНК можно ввести в эукариотические клетки, где она выживает и может экспрессироваться. В некоторых случаях чужеродная ДНК остается внехромосомной, иногда она интегрируется в геном. Взаимоотношения между внехромосомными и геномными формами необычны и скорее зависят от случайных и в некоторой степени непредсказуемых событий, чем напоминают взаимный обмен между свободными и интегрированными формами бактериальных плазмид. Тем не менее процесс может привести к стабильному изменению в геноме. Например, ДНК, инъецированная в яйцеклетки животных, способна включаться в геном, наследоваться и функционировать. Благодаря этому оказывается возможным осуществлять весьма сложные манипуляции с последовательностями ДНК как в природных, так и в экспериментальных условиях. [c.490]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

Мы предполагаем, что протоэукариот был высокоразвитой аэробной клеткой, размеры которой были крупнее размеров, свойственных прокариотам. Такая тенденция к увеличению размеров сделала необходимым... значительное увеличение поверхности дыхательной мембраны. Сначала это достигалось впячиванием внутренней мембраны клетки, а позднее образованием связанных с мембраной пузырьков, возникших от внутренней клеточной мембраны. Образовавшиеся таким образом дыхательные частицы были топологически замкнутыми объектами, окруженными мембраной, представлявшей собой избирательно проницаемый барьер между дыхательными элементами и цитоплазмой... Поскольку постоянное обновление компонентов этих сложных органелл было неэкономичным, клеткам было выгодно включить в эти органеллы механизм синтеза белков, необходимый для поддержания органеллы... Мы предполагаем, что клетка ввела систему синтеза белков в дыхательную органеллу, просто включив стабильную плазмиду, содержащую необходимые гены для рибосом-ных компонентов . [c.198]

В отличие от Agtll гибридные белки с -галактозидазой, кодируемые плазмидами pUR, обычно сохраняют ферментативную активность. Примерно 18 С-концевых аминокислотных остатков -галактозидазы, отсутствующие в гибридных белках, синтезируемых в gll, необходимы для проявления ее ферментативной активности. По нашим данным, гетерологичные фрагменты гибридных белков, включающих -галактозидазу, также более стабильны в клетках Е. соИ, когда соответствующие гены экспрессируются в pUR-векторах, а не в Agtll. Возможно, это свидетельствует о влиянии конформации -галактозидазы на конформацию гетерологичного белкового фрагмента в составе белкового гибрида. [c.140]

Имеются немногочисленные литературные данные, показывающие, что поддержание рекомбинантных плазмид в дрожжевой клетке зависит от функционирования ее митохондриального генома. Митотическая стабильность плазмиды R p- EN3 (ARS рДНК, EN3) оказалась заметно выше у мутантов rho, полученных после обработки бромистым этидием, чем у дыхательно-компетентных клеток исходного штамма (Ларионов и др. 1983). [c.95]

Находясь в бактериальной клетке, плазмиды с определенной частотой подвергаются спонтанным генетическим изменениям, таким как точечные замены нуклеотидов, делеции, дупликации, инверсии, встройки элементов типа IS (insertion sequen e) и Tn (транспозонов). Обычно такие изменения структуры природной плазмиды не дают ей селективных преимуществ в размножении перед исходным вариантом. Это обусловливает достаточно высокую стабильность структуры плазмиды в растущей культуре. Если же изменения приводят в выбранных условиях культивирования к повышению уровня наследования плазмиды клеткой или дают селективное преимущество клеткам, несущим такую плазмиду, то в процессе роста культуры исходная плазмида будет постепенно вытесняться мутантной формой. Когда наличие плазмиды снижает жизнеспособность клетки, популяция будет в процессе роста обогащаться спонтанно появляющимися бесплазмидными клетками. [c.204]

Разные плазмиды в одних и тех же условиях обладают различной стабильностью. Поэтому, несомненно, структура (генотип) плазмид имеет большое значение в детерминировании стабильности их поддержания в бактериальных клетках. Выявить основные генетические элементы плазмид, влияющие на их стабильность в клетках Е. соИ, позволила серия исследований. [c.205]

Из изученных плазмид лишь pUBllO и ее гибридные производные характеризуются достаточно высокой стабильностью в клетках бацилл. При культивировании плазмидосодержащих щтаммов на питательных средах без антибиотиков заметная потеря клетками плазмид наблюдается только в постэкспоненциальной и стационарной фазах роста культуры, что обычно мало сказывается на продуктивности штаммов по целевому белку Большое значение для стабильного поддержания гибридных плазмид в клетках бацилл имеет состав питательной среды и условия культивирования. Поэтому при создании технологических процессов на основе штаммов-продуцентов, конструируемых методами генетической инженерии, необходимо уделять пристальное внимание выбору оптимальных условий культивирования. [c.268]

Пример другой систе.мы сайт-специфической реко.мбинации предоставляет еще один умеренный фаг . oli Р1. В отличие от фага Р1 в лизогенном состоянии не интегрирует в хромосому клетки, а существует в виде автономной низкокопийной плазмидь . Стабильность наследования таких плазмид зависит от их упорядоченной сегрегации по дочерним клетка.м при делении. Механизм сегрегации. может нарушаться из-за гомологичной рекомбинации между дочерними молекулами фаговой ДНК после репликации рекомбинация [c.104]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Е. соИ. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках Е. oli стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точ-ковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага М13, использовании мутантных штаммов Е. соН типа dut ung и в переносе мутантного гена из Ml 3-вектора в экспрессирующий вектор. [c.163]

К сожалению, некоторые свойства этого штамма (чувствительность к высокой концентрации этанола, неэффективность экспрессии кДНК глюкоамилазы, поддержание плазмид только при определенном давлении отбора) делают его непригодным для промышленного использования. Однако эти недостатки удалось устранить. Во-первых, продукцию глюкоамилазы повысили примерно в 5 раз, удалив из плазмиды область отрицательной регуляции WO7-про-мотора длиной 175 п. н. Во-вторых, из плазмиды удалили дрожжевой сайт инициации репликации и встроили в нее сегмент ДНК, гомологичный участку дрожжевой хромосомы, превратив ее тем самым в интегрирующий вектор, который встраивается в дрожжевую хромосому и стабильно поддерживается в клетке. В-третьих, в качестве клетки-хозяина для модифицированной таким образом плазмиды использовали другой штамм [c.290]

Рис. 17.3. Генетическая карта Ti-плазмиды (масштаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина, которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках. За пределами Т-ДНК находится кластер г/г-генов, ген(ы), кодирующий(е) фер-мент(ы) катаболизма опина, и сайт инициации репликации ori), которьш обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в А. tumefa iens. Л и П - левая и правая фланкирующие последовательности соответственно.

Плазмиды, несушие в своем составе последовательность ori , сегрегируют неправильно для их стабилизации необходимо введение дополнительных последовательностей. Такой результат позволяет сделать два вывода сама точка начала репликации не несет информации, требуемой для распределения дуплицированных хромосом между дочерними клетками функции, необходимые для правильной сегрегации можно идентифицировать при выявлении последовательностей, которые придают плазмиде сегрегационную стабильность. [c.399]

Для введения чужеродной ДНК в интактные клетки растений используется вектор, полученный на основе Т-ДНК Agroba terium, о которой говорилось выше (см. разд. 20.3.3). Для этого гены, ответственные ш образование опухоли на растении, удаляются и замещаются желаемыми. Носле переноса модифицированной Т-ДНК в соответствующую Ti-плазмиду Agroba terium бактерии культивируют вместе с кусочками листа. Эта система позволяет Т-ДНК встроиться к хромосому растения, в результате чего новый ген стабильно включается в растительный геном (рис. 20-72). К сожалению, этот метод успешно используется лишь для некоторых семейств двудольных растений [c.438]

Рис. 21-20. Предполагаемый механизм, с помощью которого определенные папилломавирусы могут индуцировать рак шейки матки. Данные вирусы имеют кольцевую двухцеиочечную ДПК длиной около 8000 пар оснований. В клетках бородавок и других доброкачественных образований вирусные хромосомы стабильно существуют в виде плазмид и реплицируются самостоятельно. В результате редкого случайного события вирусный геном может встроиться в хромосому хозяина. При этом изменится окружение вирусных генов и нарушится контроль их экспрессии.

Главное условие для проведения экспериментов по космид-но-плазмидной рекомбинации — это отсутствие гомологии в последовательностях обоих векторов, так как это исключит возможность их гомологичной рекомбинации между иими. Кроме того, необходимо ввести космидную библиотеку, исходно сконструированную и амплифицированную в г< сЛ"-клетке, в полноценный по рекомбинации штамм, несущий селективную плазмиду (плазмиды). Наконец, необходимо обеспечить возможность селекции рекомбинантных космид после их повторного переноса в гесЛ -хозяина с тем, чтобы убедиться в стабильности клонов при их дальнейшем размножении. [c.78]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

В генной инженерии бактериальные плазмиды используют в качестве векторных систем для передачи генетического материала от хозяина (клетки донора) в клетки реципиента. Они представляют собой саморегулирующиеся кольцевые двунитевые молекулы ДНК и способны стабильно и автономно существовать в клетке в характерном для каждого типа плазмид числе копий. Саморепликация плазмиды осуществляется с помощью ферментных систем клетки-хозяина. Плазмиды относятся к подвижным элементам (векторам), т.е. способны к внутривидовому переносу между клетками популяции, клетками различных видов и родов микроорганизмов. Плазмиды, которые могут передаваться от одной бактерии к другой при конъюгации (специфический половой процесс у прокариот, обеспечивающий перенос генетического материала), называют трансмиссивными. [c.342]

Смотреть страницы где упоминается термин Стабильность плазмид в клетках: [c.73] [c.89] [c.99] [c.90] [c.267] [c.267] [c.278] [c.254] [c.266] [c.111] [c.125] [c.118] [c.146] [c.111] [c.125] [c.387] [c.412] [c.442] [c.259] [c.104]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология