ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Выбор концентраций мономеров из "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот Электрофорез и ультра-центрифугирование" Для удобства изложения используются следующие обозначения Т — процентное отношение суммарной л ассы обоих мономеров к объему их раствора, С — процентное отношение массы метилеибисакриламида к общей массе обоих мономеров. Величина Т практически варьирует в пределах 3 —30 %, а С, как правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акри-ламид/Бис в пределах от 99 1 по 19 1. Однако в некоторых особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать С до 20% и более. При указании значений Г и С значок % далее будет опущен. [c.13] Чем же диктуется выбор значений Г и С Прежде всего, на этот выбор накладывают ограничения механические и адсорбционные свойства геля. Например, гели с Г и С=1 о казыва-ются слишком мягкими и липкими — их невозможно извлечь из стеклянной формьг Для крупнопористых гелей надо увеличивать степень сшивки (повышать величину С до 3—5), т. е. отношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 1 до 20 1. При этом происходит одновременное повышение прочности геля и ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы замыкается . Мелкопористые гели (Г около 20) при высоком содержании сшивки оказываются хрупкими и мутными, поэтому для них величина С не должна превышать 1— 2. [c.13] На первый взгляд кажется очевидным, что поры НААГ тем мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величина Т. Но это не всегда так имеет смысл разобраться в этом глубже. [c.13] Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания сшивки (С) сначала повышает жесткость геля так как средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется, — именно этого и можно было ожидать. Однако далее картина меняется. Эксперимент обнаруживает, что с увеличением С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С 15 ге ль ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, расположенным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономерных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным и вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка оказывается действительно жесткой — нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров. [c.14] Между прочим, такая же ситуация возникает и при затвердевании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями. Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание круп-нопористости и прочности, характерное для этих гелей. [c.14] В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее, чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е. чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что имеет место соотношение п(и /иа) =— крТ- Величина коэффициента торможения кк (порядка 0,1 —0,4) за висит от среднего радиуса молекулы К и степени сшивки геля С, слабо увеличиваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобулярных белков К лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина (М =12 400) до 3,61 нм для церулоплазмина (М =151 000). [c.15] Для эффективного разделения белков при электрофорезе в ПААГ соотношение м Л/о должно составлять 0,1 —0,2. Отсюда следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность белков в ПААГ лежит в пределах 0,01—0,1 см/ч на 1В/ см. При напряженности поля 10— 20 В/см этому соответствуют скорости миграции белков в диапазоне 0,1 —2 см/ч. Таким образом, при рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентировки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения от них. Например, если заранее известно, что разделяемые белки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижностей (иУ т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить время фракционирования в 2—3 раза. [c.15] Ориентировочно о характере различия электрофоретических подвижностей двух белков в данных условиях разделения можно судить в том случае, когда известны их молекулярные массы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионогенных аминокислот. Чаше всего бьшают, хотя бы приблизительно, известны молекулярные массы. Если они различаются незначительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на крупнопористый гель и попробовать поварьировать pH буфера. [c.16] Пожалуй, самый суш ествениый вывод из проведенного качественного рассмотрения — заключение об определенной свободе выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем сшивки (С в пределах 2 —5 ). В любом случае выбор значений Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в которых, в частности, следует варьировать pH буфера и продолжительность электрофореза (электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия пока не рассматривается). [c.16] Приступая к электрофоретическому фракционированию биополимеров, необязательно в точности воспроизводить значения Т и С, приведенные в литературе для сходного типа экспериментов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно воспроизводить в собственной серии опытов для надежной идентификации и сопоставления положения соответствующих полос. [c.16] Вернуться к основной статье