ПОИСК Статьи Рисунки Таблицы Агароза из "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот Электрофорез и ультра-центрифугирование" При температурах 84 —9 6° (а у специальных типов — уже при 70 ) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость — плавится . Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10 —15 с П, что примерно соответствует вязкости 50%)-иого раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36— 42°). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30 . Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50 —55 и уже при этой температуре дозируют и заливают в формы это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций. [c.17] Г ели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода кристаллизацией геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему со временем он несколько уплотняется, вьщавливая из себя жидкость. [c.17] Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных гелей агарозы. [c.17] Температуры плавления и гелеобразования зависят от содержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3— 4%). Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. [c.17] В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эндосмоса, сущность которого сводится к следующему. [c.17] Отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, напротив, находятся в водной фазе и под действием электрического поля мигрируют в направлении катода. Их место занимают катионы, поступающие из анодного буфера. Возникает дополнительный ток сильно гидратированных катионов, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней — растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Они дрейфуют вместе с жидкостью, и это движение наютадывается на их миграцию под действием электрического поля. [c.17] Насколько существенно эндосмос может влиять на результаты электрофореза, видно из данных Джонсона и др. [Johnson et al., 1980]. Авторы использовали три типа агарозы с различной способностью к эндосмосу (значения —Шг составляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441 см. ниже). В одном и том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК фага ФХ 174-сверхскрученной, кольцевой и линейной. С усилением эндосмоса не только происходило сильное замедление скорости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже) менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому, различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-раз-ному. [c.18] Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результате чего полосы распльшаются с образованием хвостов . [c.18] Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-филизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентрации навеску порошка растворяют в соответствуюш ем буфере и выдерживают на кипяш ей водяной бане или в термостате при 90—95 около 2 ч для образования истинного раствора полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обратным холодильником. [c.19] Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смешивают с раствором агарозы в горячем виде (при 50 —б 0 ). Они не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов, диссоциируюш их водородные связи, несколько затрудняет образование геля. Например, гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при 15°, но не застывают за 1 ч. при 20 [Langridge et al., 1980]. [c.19] Контакт с кислородом воздуха не мешает застьшанию агарозы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нужного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом. [c.19] Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей агарозы охлаждают до 50 и выдерживают не менее 1 ч в термостате при данной температуре. Это необходимо для полного выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем обеспечивается одновременное застъшание всего геля и одно-род ностъ его структуры. [c.20] Вернуться к основной статье