Гели сиквенсные

Рис. 1. Метод РНКазного расщепления. Равномерно меченный одноцепочечный РНК-зонд транскрибируется с клонированной ДНК-матрицы. Зонд смешивают с двухцепочечным тестируемым фрагментом клонированной (геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК, и смесь нагревают для разделения цепей. Проводят отжиг РНК-зонда с комплементарной ему последовательностью в тестируемой ДНК и получают гибридные дуплексы. Если во фрагменте ДНК имеется единичная нуклеотидная замена, то в гибриде РНК—ДНК окажется однонуклеотидный неспаренный участок. Реассоцнированный образец обрабатывают РНКазой А, которая расщепляет цепь РНК по неспаренным участкам. Отметим также, что РНКаза А удаляет выступающие 3 - н 5 концы дуплекса. Дуплекс обрабатывают денатурирующими веществами для разделения цепей, затем проводят электрофорез в денатурирующем (сиквенсном) геле и фрагменты РНК фракционируют по размеру. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Если в тестируемой ДНК нет мутаций, на радиоавтографе наблюдается одна полоса, соответствующая по размеру длине

Оба реактива должны быть самой высокой степени чистоты. Заметим, что отношение акриламида к бисакриламиду в растворе 37,5 1, т. е. степень сшивки в геле примерно в половину меньше, чем в используемых обычно сиквенсных гелях. [c.155]

Гели для параллельно-градиентного электрофореза готовят так же, как гели с перпендикулярным градиентом, и электрофорез проводят аналогичным образом. По бокам от вершины к основанию вставляют два боковых спейсера точно так же, как в сиквенсных гелях или гелях для анализа белков. После закрепления в аппарате для электрофореза боковые стороны и основание пластин заливают, как обычно, агарозой. Раствор заливают так же, как при обычном вертикальном форезе, только, не сбоку, а сверху. После заливки вставляют дельриновую или тефлоновую гребенку и оставляют гель полимеризоваться. Иа заполимеризовавшегося геля вынимают гребенку и помещают установку в ванну с нагретым буфером. Все необходимое снаряжение подсоединяется, как при обычном вертикальном электрофорезе. [c.159]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология