Единичные нуклеотидные замены

Единичные нуклеотидные замены [c.6]

Единичные нуклеотидные замены во фрагментах геномной ДНК можно обнаружить при расщеплении неспаренных участков в РНК—ДНК-дуплексах, обрабатывая эти дуплексы РНКазой А [15, 16]. Рис. 1 иллюстрирует последовательные этапы процедуры. [c.124]

Общеизвестно, что нуклеотидный состав фрагментов ДНК влияет на температуру их плавления. Оптимальные условия для отжига и отмывки нуклеиновых кислот в реакциях гибридизации подбирают исходя из их нуклеотидного состава. В гораздо меньшей степени учитывается вклад стэкинг-взаимодействий в термодинамическую стабильность двойной спирали. А между тем энергия таких взаимодействий между соседними нуклеотидами одной цепи ДНК, удерживающих ее в скрученном состоянии в физиологических растворах, больше энергии водородных связей комплементарного спаривания [29]. Порядок чередования оснований определяет степень стэкинга и, следовательно, влияет на термостабильность фрагмента ДНК. Даже единичная нуклеотидная замена может так сильно сказаться на стэкинг-взаимодей-ствии, что Гт изменится более чем на 1 °С. Поскольку процесс плавления домена практически полностью определяется кооперативными взаимодействиями, любая единичная нуклеотидная замена в любой его точке будет менять температуру плавления. [c.129]

Рис. 1. Метод РНКазного расщепления. Равномерно меченный одноцепочечный РНК-зонд транскрибируется с клонированной ДНК-матрицы. Зонд смешивают с двухцепочечным тестируемым фрагментом клонированной (геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК, и смесь нагревают для разделения цепей. Проводят отжиг РНК-зонда с комплементарной ему последовательностью в тестируемой ДНК и получают гибридные дуплексы. Если во фрагменте ДНК имеется единичная нуклеотидная замена, то в гибриде РНК—ДНК окажется однонуклеотидный неспаренный участок. Реассоцнированный образец обрабатывают РНКазой А, которая расщепляет цепь РНК по неспаренным участкам. Отметим также, что РНКаза А удаляет выступающие 3 - н 5 концы дуплекса. Дуплекс обрабатывают денатурирующими веществами для разделения цепей, затем проводят электрофорез в денатурирующем (сиквенсном) геле и фрагменты РНК фракционируют по размеру. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Если в тестируемой ДНК нет мутаций, на радиоавтографе наблюдается одна полоса, соответствующая по размеру длине

ГО электрофореза в агарозном геле. При этом в ряде случаев не удается полностью разделить гибриды РНК—ДНК и результаты получаются противоречивыми, так как фрагменты РНК, полученные при расщеплении ее по неспаренным участкам, но оставшиеся связанными с ДНК, обнаруживаются в геле в зонах, соответствующих длине всего зонда. Для более эффективного выявления единичных нуклеотидных замен путем РНКазного расщепления мы использовали по несколько зондов в каждой реакции отжига/расщепления. Однако полученные таким способом результаты зачастую очень неоднозначны и с трудом поддаются интерпретации. В силу перечисленных причин при исследовании фрагментов ДНК на единичные замены мы бы рекомендовали использовать в реакциях РНКазного расщепления РНК-зонды длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. [c.128]

Если ген рассматривать как характерный пример, то представляется вполне вероятным, что на уровне последовательности ДНК каждый перекрестноразмножающийся организм может быть гетерозиготным почти по всем, если не по всем, локусам. Так дело обстоит, если принимать в рассмотрение некод1фующие участки последовательности. Понятие гетерозиготности следует сформулировать заново, исходя из доли нуклеотидных различий, т.е. говорить о нуклеотидной гетерозиготности или нуклеотидном разнообразии. Если рассматривать только замены, то нуклеотидная гетерозиготность у составляет 13/1647 = = 0,008. Возникает вопрос, как можно включить в рассмотрение делеции Если каждую делецию рассматривать как одно дополнительное отличие безотносительно к ее размеру, то следует принять во внимание три дополнительных различия между двумя аллелями, и тогда гетерозиготность составит 16/1647 = 0,010 если же считать единичным отличием утрату каждого нуклеотида, то значение гетерозиготности будет 39/1647 = 0,024 (см. табл. 22.15). [c.101]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология