Разделение цепей

Рис. 5.18. Первый раунд ПЦР. ДНК-мишень фланкирована последовательностями Г—2 в одной цепи и последовательностями 1—2 — в другой. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу и четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP). Смесь нагревают до 95 С, инкубируют в течение 1 мин и медленно охлаждают до 55 °С. При этой температуре праймеры, добавленные в избытке, спариваются с разделенными цепями. Повышают температуру до 75 °С. В этих условиях происходит синтез обеих цепей ДНК, начинаюший-ся с 3 -гидроксильных концов праймеров. Каждая из синтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3 -гидроксильной группы ее праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Эти цепи служат матрицами во втором раунде ПЦР.

Рис. 8.6. Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отдельности с помощью ПЦР. Соответствующие праймеры показаны горизонтальными стрелками. Вырожденные олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотиду, не комплементарному соответствующему нуклеотиду в гене-мишени. Амплифици-рованные фрагменты очищают, денатурируют до полного разделения цепей и ренатури-руют. В результате образуются частично двухцепочечные молекулы ДНК, спаренные в области гена-мищени. Их достраивают с помощью ДНК-полимеразы и проводят ПЦР-амплификацию. ПЦР-продукты расщепляют эндонуклеазами рестрикции А и В и встраивают в вектор, обработанный теми же ферментами.

При исследовании субстратов с длинной цепью [149] было установлено, что некоторые нативные белки устойчивы к действию фермента, в то время как белок с развернутыми цепями, а также окисленный или денатурированный белок легко гидролизуется. Например, цинковый комплекс инсулина почти не расщепляется ферментом, но удаление цинка облегчает ступенчатый гидролиз. В этом случае гидролиз не затрагивает дисульфидных мостиков. Разделенные цепи А и Б окисленного инсулина легко гидролизуются. Аминокислотный анализ свидетельствует о гидролизе всех связей в цепи- А, в то время как более медленный гидролиз цепи Б позволил установить последовательность первых шести остатков в этой цепи. [c.236]

Энергия активации диффузии Ев представляет собой энергию, необходимую для проведения одного моля молекул газа через элементарный процесс. Вероятно, Ев можно рассматривать ка> работу разделения цепей, в связи с чем значение Ев увеличивается с ростом размеров молекул газа . Согласно теории зон Баррера перенос молекулы газа в эластомере может иметь место, когда концентрация тепловой энергии становится достаточной для разделения локализованных цепей и [c.115]

Кинетика расплетания двойной спирали ДНК была впервые исследована Куном (1957). Расплетание возникает после разрыва связей между цепями. Если допустить, что оно происходит в результате вращательного броуновского движения, то этот процесс потребует времени т, гораздо большего, чем наблюдаемое. Так, для ДНК с м. м. 3 10 раскручивание 450 витков спирали, что необходимо для полного разделения, требует 150 дней. Между тем т для ДНК с м. м. порядка 10 составляет около 1 мин. Кун рассмотрел разделение цепей, происходящее при сочетании вращательного теплового движения с поступательным, и получил для ДНК с м. м. 3 10 т порядка 1 мин, что также слишком много. [c.242]

Аналогичное рассмотрение денатурации ( 7.4) приводит к значению разности свободных энергий разделенных цепей и двойной спирали, равному [c.250]

ПЕРЕМЕШАННЫЕ ЦЕПИ ИЛИ РАЗДЕЛЕННЫЕ ЦЕПИ [c.62]

Принцип метода состоит в том, что двухспиральные молекулы высокополимерных ДНК денатурируют нагреванием в разделенные цепи ДНК закрепляют в гелевой структуре агара [14], [21]. [c.113]

Энергия активации диффузии Ев представляет собой энергию, необходимую для прохождения одного моля газа в элементарном акте диффузии. Ее, вероятно, можно рассматривать как работу разделения цепей, в связи с чем значение Ев увеличивается с ростом размеров молекул газа. [c.348]

Менее ясен вопрос о денатурации под действием органических растворителей. Хотя при действии формамида разделение цепей происходит вероятно, возможны случаи денатурации и без разделения цепей [c.267]

Если в линейной и в нековалентно-замкнутых ДНК в процессе денатурации возможно разделение цепей, то в двухспиральной циклической ковалентно-замкнутой ДНК этот процесс исключен. Кроме того, на процессы денатурации в этом случае оказывает влияние наличие сверхспиральной структуры. [c.268]

Описываемые опыты были одним из первых адекватных доказательств разделения цепей ДНК в результате денатурации. [c.275]

Денатурация. Денатурацией называют процесс разрушения двухцепочечной вторичной структуры ДНК. В прошлом было не вполне ясно, обязательно ли при этом происходит разделение цепей. Можно легко представить себе разрушение двухцепочечной структуры ДНК и без разделения цепей. После того как денатурация произошла, целый ряд факторов мешает спонтанному восстановлению структуры, т. е. спариванию комплементарных оснований и образованию спирали, характеризующейся теми же параметрами, что и исходная. Денатурирующие агенты часто вызывают и более глубокие изменения, например нагревание приводит к уменьшению числа пуриновых оснований в полинуклеотидных цепочках. [c.319]

При повышении температуры раствора регулярная структура ДНК местами нарушается и на отдельных участках в результате разрыва связей спаренных оснований возникают петли. Когда температура достигает значений, близких к температуре перехода, спирализованные участки и участки, где цепи расплетены и образуют петли, перемежаются друг с другом и находятся в равновесии. Дальнейшее повышение температуры до точки плавления приводит к сильному сдвигу равновесия в сторону петель (этот процесс сопровождается увеличением поглощения в ультрафиолете). На этом этапе структура молекулы полностью разрушается. При температурах несколько более высоких происходит окончательное разделение цепей. [c.321]

Полиизобутилены являются третьим примером высокомолекулярного алифатического углеводорода с регулярной структурой. Полимеры эти — некристаллические вещества и в зависимости от молекулярного веса варьируют от масел до полутвердых смол. Однако, если твердые полиизобутилены растянуть, они дают рентгенограмму, ясно указывающую на наличие кристаллизации [4]. Таким образом, регулярное диметилирование каждого второго атома углерода в длинных углеродных цепях вызывает такое разделение цепей, чтобы помешать кристаллизации в нерастянутом образце. Однако ориентация цепи, вызванная растяжением материала, делает кристаллизацию возможной. [c.169]

Синтез (репликация) ДНК должен происходить таким образом, чтобы образовались две новые цепи двухтяжевой ДНК с той же самой последовательностью оснований, т. е. той же генетической информацией, что и родительская. Благодаря такому процессу из данной родительской клетки возникают две дочерние. Репликация становится возможной потому, что двухтяжевая родительская ДНК разделяется на отдельные нити, из которых каждая служит матрицей для синтеза новой спирали. Если бы две цепи были ковалентно связаны, энергия, необходимая для разделения цепей, была бы весьма значительной. Сохранение последовательности оснований в процессе репликации происходит благодаря высокой специфичности при образовании водородных связей между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Так что, например, аденин на одной цепи двойной спирали всегда будет находиться напротив и образовывать водородные связи с тимином во второй цепи. При разделении цепей аденин из одной цепи всегда будет взаимодействовать с тимином в процессе синтеза новой комплементарной цепи. Аналогичным образом тимин, который находился напротив аденина в родительской двойной спирали, после разделения цепей будет взаимодействовать в процессе синтеза новой комплементарной цепи с аденином. Следовательно, на каждой из разделенных цепей родительской двойной спирали, как на матрице, синтезируются две новые цепи двухспиральмой ДНК, обладающие совершенно одинаковой последовательностью оснований с родительской молекулой. Такой механизм синтеза ДНК называется полуконсервативным механизмом репликации, поскольку исходная двойная спираль наполовину сохраняется (рис. 3.9), т, е, каждая из двух образовавшихся двойных спиралей содержит одну цепь из родительской молекулы. [c.148]

Раскручивание двойной спирали и пространств, разделение цепей осуществляется при помощи неск. спец. белков. Т. наз. геликазы расплетают короткие участки ДНК, находящиеся непосредственно перед репликац. вилкой. На разделение каждой пары оснований расходуется энергия гидролиза двух молекул АТФ до аденозиндифосфата и фосфата. К каждой из разделившихся цепей присоедшгяется неск. молекул ДНК-связывающих белков, к-рые препятствуют образованию комплементарных пар и обратному воссоединению пепей. Благодаря этому нуклео гиднью последовательности [c.253]

После разъединения полипептидных цепей белка удается выделить отдельные цепи в чистом виде, что сложнее сделать в случае длинных полипептидных цепей [306], чем коротких цепей, для выделения которых в чистом виде можно применять различные методы, например хроматографию на бумаге [320] и на колонке [219, 277], противоточное распределение [331] и ионофорез [10, 266]. В окисленном инсулине, в котором обе цепи сильно различаются по кислотности из-за неодинакового аминокислотного состава, разделение цепей удается осуществить фракционированием солей [263], ионофо-эезом [143, 263], распределительным хроматографированием 6] или противоточным распределением [190, 240]. Окисленный химотрипсин, содержащий три пептидные цепи, дает три фракции с характерными свойствами, позволяющими разделять их. комбинацией метода осаждения при pH 6 и ионообменного хроматографирования створимого вещества. [c.177]

Ферментативный гидролиз нативных белков, как правило, протекает менее полно, чем гидролиз денатурированных белков и белков с разделенными цепями в аналогичных условиях [128]. Во многих случаях в результате такого более специфического расщепления пблучаются более крупные обломки исходной молекулы. Ранее отмечалось, что после окисления ри бонуклеаза в большей степени подвержена ферментативному гидролизу. [c.178]

Необходимо отметить, что разделение цепи на несколько сегментов спиральной и клубковой конформаций согласуется с более общим рассмотрением Ландау и Лифшица [791]. Авторы утверждают, что в одномерном случае разделение на две отдельные фазы невозмож- [c.299]

С ТОЧКИ Зрения фундаментальной структуры и биологической правильности спаривание АсТиОсСне вызывает сомнений. Эта комплиментарность лежит в основе корреляции между структурой и функцией нуклеиновых кислот (см. гл. 22.5). Она является также основной особенностью предложенной недавно альтернативной вторичной структуры ДНК, где сделана попытка решить одну проблему, на которую не дает ответа модель Уотсона-Крика. Это ни что иное как серьезные топологические затруднения, возникающие при разделении цепей полностью заплетенной двойной спирали ДНК в процессе биологической репликации (см. разд. 22.5.1.1). [c.46]

Возможность внутреннего разупорядочения двойной спирали без разделения цепей, по-видимому, действительно существует. В работе [124] наблюдалась денатурация кольцевой двуспиральной ДНК без раскручивания. Время денатурации некольцевой фаговой ДНК (около 25 сек) зависит от молекулярного веса. Для ряда видов фаговых ДНК оно пропорционально Квадратичная зависимость следует непосредственно из того, что г должно быть, пропорционально числу витков, т. е. М, и вязкости среды, т. е. также М. Мэсси и Зимм [125] исследовали денатурацию ДНК релаксационными методами (см. 7.7) и установили, что т зависит от многих факторов — от стадии перехода спираль— клубок, от ионной силы растворителя и его вязкости, от концентрации ДНК и ее молекулярного веса, а также от числа и расположения разрывов в цепи. Итак, [c.523]

Та же релаксационная техника (температурный скачок) применялась к изучению денатурации ДНК в работе [126]. Это исследование показало наличие трех последовательных процессов. При малом температурном скачке (от 6 до 18 °С) сначала возникает мгновенный ответ (т С 20 мсек), состоящий в быстрой структурной дезорганизации спирали без разделения цепей. Дезорганизация должна начинаться в участках с избытком пар А — Т. За мгновенным ответом следует постепенная деспирализация, которую авторы назвали быстрым эффектом. Длительность этого процесса пропорциональна Далее малые температурные возмущения в области перехода проявляются в весьма медленном кинетическом эффекте, характеризующемся большой энергией активации (- 100 ккал/моль) и практически не зависящем от молекулярного веса. Он может быть истолкован как явление нуклеации в кооперативном переходе, т. е. как уничтожение спиральных участков, разделяющих неупорядоченные. [c.523]

Химическая структура нуклеиновых кислот будет описана в 2.3. Здесь же уместно кратко описать основные принципы, заложенные в структуре молекулы ДНК, которые обеспечивают возможность самокопирования ДНК независимо от нуклеотидной последовательности. При делении клетки информацию, заложенную в молекулах ДНК этой клетки в виде определенной последовательности нуклеотидов, необходимо передать двум вновь образованным дочерним клеткам. Поэтому из одной молекулы ДНК перед клеточным делением должно образоваться две с той же нуклеотидной последовательностью. В живых организмах ДНК в период между ее удвоением всегда существует в виде двух связанных друг с другом полинуклеотидных цепей (нитей). Связь эта осуществляется в результате того, что каждый из четырех составляющи. ДНК типов нуклеотидов резко предпочтительно взаимодействует с одним из тре.ч остальных. Поэтому нуклеотидные последовательности этих нитей взаимно однозначно соответствуют друг другу, или, как принято говорить, комплементарны друг другу. Следовательно, каждая цепь содержит информацию о комплементарной нуклеотидной последовательности другой цепи. Будучи разделенными, цепи со.чраняют необходимую информацию для построения из нуклеотидов новы.к комплементарны. цепей и, таким образом, осуществляют воспроизведение информации, заложенной в двуспиральной структуре. Процесс самоудвоения ДНК, т.е. образования двух новых двуни-тиевых молекул ДНК, идентичных первоначальной молекуле, называют репликацией ДНК. Химические события, лежащие в процессе репликации, состоят в последовательном присоединении нуклеотидов друг к другу. Этот процесс в живых организмах осуществляет специальный фермент — ДНК-полимераза. Изучение свойств и механизмов функционирования этого фермента в клетке показало, что он работает только в присутствии материнской двуспиральной ДНК. Цепи материнской ДНК направляют образование новых комплементарных цепей, т.е. на каждой стадии роста новой цепи осуществляют отбор одного из четырех мономеров и присоединения его к растущей цепи. [c.18]

Тремя главными матричными процессами, присущими всем без исключения живым организмам, являются репликация ДНК, транскрипция и трансляция. Репликация ДНК происходит с участием ферментов ДНК-полимераз. Роль матриц играют разделенные цепи двунитевой материнской ДНК. Субстратами являются дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфаты. Транскрипция осуществляется с помощью ферментов РНК-полимераз. Матрицей служит одна из нитей двунитевой ДНК, а субстратами — рибонуклеозид-5 -трифосфаты. Трансляция происходит на рибосомах с участием информационной РНК (мРНК) в качестве матрицы и аминоз1Ц1л-тРНК в качестве субстратов. Кроме того, при заражении клеток вирусами, у которых наследственная информация содержится в молекулах вирусных РНК, в клетках начинается запрограммированный этими РНК синтез ферментов, называемых обычно РНК-репликазами, которые катализируют биосинтез РНК, используя в качестве матриц молекулы РНК. Некоторые вирусы, вызывающие злокачественные новообразования, содержат ферменты, катализирующие обратную транскрипцию — синтез ДНК с использованием в качестве матриц молекул РНК. Эти ферменты часто называют обратными транскриптазами или ревертазами. Более строгие названия двух последних групп ферментов соответственно — РНК-зависимая РНК-полимераза и РНК-зависимая ДНК полимераза. [c.174]

Сэнгером при установлении аминокислотной последовательности бьгаьего инсулина эта последовательность приведена на рис. 6-11. Бычий инсулин имеет молекулярную массу около 5700. Его молекула состоит из двух полипептидных цепей А-цепи, содержащей 21 аминокислотный остаток, и В-цепи, содержащей 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи соединены двумя дисульфидными (—8—8—поперечными связями, причем в одной из цепей имеется еще одна внутренняя дисульфидная связь. При определении последовательности вначале были разорваны поперечные дисульфидные связи, что позволило разделить цепи. Для этой цели Сэнгер использовал в качестве окислителя надмуравьиную кислоту, которая расщепляет каждый остаток цистина на два остатка цистеи-новой кислоты (рис. 6-12), по одному в каждой цепи. После разделения цепей в них были определены аминокислотные последовательности. При этом не удалось обнаружить никаких закономерностей в расположении какой-либо аминокислоты, никаких периодических повторений того или иного аминокислотного остатка. Более того, последовательности двух цепей оказались совершенно разными. [c.153]

Фиг. 35. Образование гибридного полинуклеотида. Нагреванием полимера д (Г) д (Ц) вызвали разделение цепей. Затем одиночные цепи, содержащие гуанин, были нагреты вместе с одиночными цепями рибоподинуклеотида, содержащего цитозин, что привело к образованию рибо-де-зоксирибополинуклеотидного гибрида.

Несмотря на привлекательность этой гипотезы, ряд возникших затруднений не позволяет принять ее в такой простой форме. В частности, трудно представить себе, каким образом могут раскрутиться цепи такой длинной спирали, как молекула ДНК. хотя несколько возможных решений этой проблемы кажутся весьма остроумными [5, 6, 150, 151, 163]. Для разделения каждых 10 пар оснований молекуле надо повернуться один раз вокруг своей оси. Тогда Д.ЛЯ полного разделения цепей мо.лекз та должна вращаться [c.194]

Возьмем, например, индукщтонный эффект. Без сомнения, в огромном числе случаев взаимное влияние атомов, разделенных цепью простых связей, передается путем индукции. Одиако все же есть случаи, где такая передача взаимного влияния не может быть объяснена индукционным эффектом. [c.221]

Конечным итогом денатурации при действии температуры, кислоты или щелочи может быть разделение цепей двухспиральной молекулы 3, Это следует из очень медленного восстановления свойств, характерных для исходной (нативной) ДНК, в процессе ренатурацин (см. ниже) после достаточно продолжительного инкубирования ДНК в условиях денатурации. С этим согласуется, кроме того, второй порядок скорости реакции ренатурации, данные электронной микроскопии з а также изменение гидродинамических характеристик молекулы при денатурации °з, збо Однако наиболее убедительным доказательством, по-видимому, является возможность разделения комплементарных цепей после денатурации 109. 185-195 [c.267]

Возможность существования двухспиральной молекулы ДНК как целого со значительными нарушениями внутри двойной спирали следует из опытов по денатурации ДНК путем нагревания Б присутствии формальдегида 79-181 На электронных микрофотографиях обработанной таким образом ДНК обнаруживаются локально денатурированные участки, относительное содержание нуклеотидов в которых увеличивается с повышением температуры или увеличением продолжительности обработки формальдегидом. Распределение таких участков не случайно, а соответствует всегда определенным местам молекулы. Можно полагать, что это участки, богатые парами аденин тимин. По мере повышения температуры размеры таких участков увеличиваются, они сливаются, и конечным результатом является разделение комплеД1ентарных цепей. Следует отметить, что денатурация в присутствии формальдегида отличается от обычной тепловой денатурации, поскольку она сопровождается химическим взаимодействием с формальдегидом, так что ренатурация областей, содержащих модифицированные звенья, невозможна. В результате этого при каждой данной температуре — а не только при температуре плавления — конечным итогом денатурации является разделение цепей Поэтому на основании опытов с использованием формальдегида для фиксации частично денатурированных областей в молекулах ДНК в интервале плавления нельзя делать выводов об истинных размерах и распределении этих областей при данной температуре в отсутствие формальдегида. [c.268]

При дальнейшем подщелачиванш ДНК Г продолжается раскручивание двойной спирали Уотсона — Крика, однако в отличие от линейной и нековалентно-замкнутой ДНК этот процесс происходит без разделения цепей, что понижает энтропию денатурированного состояния и, следовательно, делает денатурацию менее выгодной (чем в случае линейной и нековалентно-замкнутой ДНК). Конечным итогом денатурации является образование плотного клубка с высоким коэффициентом седиментации (IV на рис. 4.19). Если в такой денатурированной молекуле провести разрыв в одной из цепей, то возникают циклическая одноцепочечная ДНК с коэффициентом седиментации 18S (V на рис. 4.19) и линейная одноцепочечная ДНК с коэффициентом седиментации 16S (VI). Формы V и VI получаются также при щелочной денатурации ДНК П. [c.270]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология