Дуплексы гибридные

Рис. 4. Выявление единичных нуклеотидных замен методом ДГГЭ. Меченый одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд смешивают с двухцепочечной (клонированной, геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК смесь нагревают для разделения цепей. Происходит отжиг зонда с комплементарной ему цепью тестируемого фрагмента, при этом образуются гибридные дуплексы. Если в исследуемом образце имеется мутация, то в гибриде будет однонуклеотидный неспаренный участок. После отжига к смеси добавляют избыток одноцепочечной кольцевой ДНК, комплементарной зонду, для удаления его остатков. Проводят электрофорез смеси в денатурирующем градиентном геле. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Наличие неспаренных участков в мутантных образцах ДНК, изменяющих характер плавления, приводит к тому, что эти фрагменты оказываются в геле ближе к старту вследствие пониженной термостабильности. Преимущество такого метода разделения мо- чекул с неспаренными участками в его повышенной разрешающей способности.

Из приведенной достаточно сложной схемы видно, что на протяжении функционирования происходят нетривиальные события. Так, иа первой фазе идет-образование гибридного дуплекса участка R—Us. Если бы в момент обратной транскрипции участка R Us в работу одновременно включилась активность РНКазы Н, мог бы деградировать еще не прочитанный участок геномной РНК и процесс был бы нарушен. Разрешение на включение РНКазы Н должно даваться только по завершении обратной транскрипции на 5 -конце геномной РНК. Нетривиальным событием является скачок, совершаемый геномной РНК после освобождения фрагмента ДНК от РНК. Важным и нетривиальным событием является последующий разрыв геномной РНК в определенной точке перед фрагментом U3, чем задает ся структура длинного концевого повтора. Опять- аки нетрудно заметить, что вопрос о переключении активностей в пределах одного работающего фермента также требует рассмотрения с позиций молекулярной динамики. [c.227]

Бреннер и соавторы считают, что изменение степени связывания между различными ДНК в зависимости от температуры инкубации дает информацию о количестве парных оснований, присутствующих в дуплексах ДНК. В строгих условиях эксперимента в гибридной ДНК практически все основания комплементарны, а ее тепловая стабильность близка к стабильности нативной ДНК. [c.81]

ГЕТЕРОДУПЛЕКСНАЯ (ГИБРИДНАЯ) ДНК. Образуется при спаривании одноцепочечных комплементарных ДНК из разных родительских дуплексов возникает в процессе генетической рекомбинации, [c.520]

Последовательности, образующие дуплексы, не обязательно комплементарны по всем нуклеотидам. Долю некомплементарных пар нуклеотидов в межвидовых дуплексах ДНК можно определить по скорости разделения цепей ДНК в дуплексах при повышении температуры. Для этого используется величина 7 , характеризующая термостабильность ДНК. Она представляет собой температуру, при которой диссоциирует 50% двухцепочечной ДНК (рис. 26.5). Разность (Д7 ) между значениями 7 гибридных и контрольных молекул ДНК, равная ГС, соответствует примерно 1% некомплементарных пар нуклеотидов. Результаты, полученные при сравнении ДНК различных приматов с ДНК человека и зе- [c.220]

Рестриктаза. Эндонуклеаза, расщепляющая обе цепи ДНК в строго определенных сайтах со специфической последовательностью оснований. Саузерн-блоттинг. Метод переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр с последующей гибридизацией с меченым зондом. Сигнал. Конечный этап визуализации определенного фрагмента ДНК (клона). Например, при радиоавтографии—темное пятно на рентгеновской пленке, соответствующее месту нахождения гибридного дуплекса, одна из цепей которого является радиоактивно меченным зондом. [c.51]

Знак /> в дуплексе — инициирующий кодон для синтеза гибридного белка [c.410]

A. Три пика в градиенте плотности представляют собой (в направлении от легкого пика к тяжелому ) нереплицированную ДНК, ДНК, реплицированную один раз, и ДНК, реплицированную дважды (рис. 9-42). Инъецированная ДНК помечена Н, но во всех остальных отношениях это нормальная легкая ДНК. Каждая новосинтезированная цепь включает метку и БУДР, который увеличивает ее плотность. Следовательно, после одного цикла репликации ДНК будет обладать промежуточной плотностью и содержать одну легкую цепь, меченную Н, и одну тяжелую , меченную Р. После второго цикла репликации из гибридной ДНК образуются один дуплекс, гибридный по плотности, и один дуплекс, содержащий две тяжелые цепи, меченные Р. Полностью тяжелый дуплекс расположен в самой плотной области градиента. Поскольку полностью легкая ДНК не реплицировалась, в ней не будет содержаться Р, а так как полностью тяжелая ДНК содержит две новые цепи, в ней не будет присутствовать Н. Образование дискретных пиков в этом эксперименте имеет принципиальное значение, так как показывает, что мечение связано главным образом с репликацией, а не с репаративным синтезом. Если бы включение метки бьшо связано с репаративным синтезом, который осуществляется мозаично, то метка распределилась бы по всему градиенту, а не собралась в дискретных пиках. [c.398]

Два фермента обеспечивают высокую избирательность инициации синтеза ДНК, ограничивая инициацию репликации только ориджином. Это топоизомераза I и РНКаза Я, избирательно гидролизующая РНК в составе гибридных дуплексов с ДНК-Действие этих фер.ментов направлено против гибридных ДНК—РНК-участков, которые могут случайно образоваться на ДНК при транскрипции и послужить затравками для начала синтеза ДНК. Возможная роль в этом процессе РНКазы Н очевидна она способна непосредственно гидролизовать РНК во всех таких участках. Что касается роли топоизомеразы I, то необходимо отметить, что гибриды ДНК— РНК образуются лишь в том случае, если ДНК сверхспирализована (образование гибридного дуплекса снимает часть избыточной энергии сверхспирализации), причем сверхспирализована достаточно сильно, чтобы локальные нарушения нормальной вторичной структуры ДНК могли способствовать гибридизации с РНК- Топоизомераза I может релаксировать сверхспиральную ДНК лишь в том случае, если она сверхспирализована отрицательно и достаточно сильно, т. е. в условиях, способствующих возникновению на ДНК упомянутых локальных нарушений вторичной структуры. Таким образом, можно думать, что одна из функций этого ( рмента состоит в поддержании нормальной вторичной структуры ДНК, препятствующей ее гибридизации с РНК и образованию затравки. В мутантах Е. oli по РНКазе Н (ген rnh) или по топоизомеразе I (ген [c.62]

Вирус ВИЧ в составе зрелой внеклеточной частицы содержит геномную молекулу РНК. Однако развитие вирусной инфекции связано с этой РНК лишь в самой начальной фазе. По информации, содержащейся в этой РНК, воспроизводится молекула ДНК, сначала однонитевая. Затем на ней, как на матрице, воспроизводится комплементарная цепь и образующаяся двунитевая ДНК встраивается в геном инфицированной клетки. Именно эта ДНК далее управляет синтезом копий мРНК, необходимых для программирования синтеза вирусных белков, и самой РНК вириона, которая должна входить в состав новых вирусных частиц. Исходная же РНК при синтезе ДНК постепенно уничтожается с помощью активности, известной под названием РНКазы Н. Этот фермент катализирует гидролитическое расщепление РНК в составе гибридного дуплекса РНК-ДНК. Таким образом, для формирования двунитевой ДНК копии геномной РНК вируса ВИЧ-1 необходимо проявление трех активностей обратной транскрипции для синтеза однонитевой ДНК, ДНК-полимеразной активности для получения двунитевой ДНК и, наконец, активности РНКазы Н. Оказывается, все эти активности присущи самой обратной транскриптазе вируса БИЧ-1. Однако самое удивительное состоит в том, что переключение активностей проис.ходит строго упорядоченно, это не просто три параллельно работающих активных центра на одном ферменте. Последовательность происходящих событий представлена на рис. 68. Рассмотрим ее более подробно. [c.225]

Если дуплексы ДНК, вьщеленные из клеток человека и мыщи, денатурировать нагреванием по отдельности, а затем смешать и выдерживать при 65°С в течение многих часов, то ббльшая часть цепей мышиной ДНК отжигается с комплементарными цепями мышиной ДНК с образованием исходного дуплекса аналогичным образом большинство цепей ДНК человека воссоединяется с комплементарными цепями ДНК человека. Од-на1ко наряду с этим некоторое число одиночных цепей ДНК мыши будет связываться с одиночными цепями ДНК человека, в результате чего появляются гибридные дуплексы, в которых отдельные участки цепей ДНК мыши обра- [c.866]

Рис. 27-15, Принцип гибридизационного теста. Два препарата ДНК, выделенной из организмов разных идов, нагревают так, что они полностью денатурируют и их цепи расходятся. При смешивании этих препаратов и медленном охлаждении комплементарные цепи ДНК каждого вида на йдут друг друга и будут ренатурировать с образованием нормальных дуплексов. Если между двумя ДНК существует значительная гомология по последовательности, то возможно образование гибридных молекул, представляющих собой частичные дуплексы. Чем выше степень гомологии, тем больше вероятность образования гибридов. Содержание гибридов в смеси можно измерить разными способами, в частности с помошью хроматографии или центрифугирования в градиенте плотности. Обычно, чтобы упростить процедуру измерения, одну из ДНК метят радиоактивным изотопом.

Гибридизация ДНК - ДНК и ДНК - РНК. Если дуплексы ДНК, выделенные из клеток человека и мыши, денатурировать нагреванием по отдельности, а затем смешать и выдержать в течение многих часов при температуре ниже температуры плавления, то большая часть цепей мышиной ДНК отжигается с комплементарными цепями мышиной ДНК с образованием исходного дуплекса. Аналогичным образом большинство цепей ДНК человека воссоединяется с комплементарными цепями ДНК человека. Наряду с этим некоторое число одиночных цепей ДНК мыши будет связываться с одиночными цепями ДНК человека, в результате чего появляются гибридные дуплексы, в которых отдельные участки цепей ДНК мыши образуют двухцепочечные области с участками цепей ДНК человека (при наличии комплементарных пар оснований). Гибридные дуплексы возникают только при условии, что между ДНК двух разных видов существует комплементарное сходство в нуклеотидных последовательностях. Чем ближе родство двух видов, тем в большей степени их ДНК будут образовывать гибриды. Например, ДНК человека гораздо лучше образует гибриды с ДНК мыши, чем с ДНК дрожжей. При наличии комплементарных пар оснований возможно образование гибридных дуплексов ДНК — РНК. Например, в ходе транскрипции новосинтезируемая цепь РНК временно образует короткие отрезки гибридной двойной спирали ДНК — РНК (за счет спаривания ее оснований с основаниями матричной цепй ДНК). Гибридизационные тесты используют в биохимической генетике для определения того, насколько близки два вида для установления связи данной ДНК с какой-либо РНК для выделения и очистки генов и РНК и определения их нуклеотидных последовательностей. [c.300]

Для начала реакции синтеза ДНК ДНК-ревертазе, как и всем ДНК-по-лимеразам, необходима затравка в виде небольшого дву цепочечного отрезка. Если добавить в реакцию короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, состоящие из 18— 20 тиминовых остатков (поли дТ), то они будут гибридизоваться (образовывать по принципу комплементарности двуцепочечные ДНК-РНК-фрагменты) с поли(А)-последовательностью мРНК — и такой дуплекс будет служить затравкой для начала ферментативной реакции (рис. 1.9). В результате образуется гибридная РНК-ДНК-молекула, причем на конце у нее фермент будет синтезировать короткий отрезок двуцепочечной ДНК — шпильку. Шпилька может служить затравкой для синтеза второй комплементарной цепи ДНК, который осуществляет уже фермент ДНК-полимераза I (рис. 1.9). Цепь мРНК гидролизуют РНКазой. С помощью эндонуклеазы 81, которая специфически [c.43]

Биологическая роль Л-формы является предметом дискуссий. Известно, например, что двуспиральные участки и РНК находятся в Л-конформации. Это происходит потому, что 2-ОН-группа рибозы в РНК, в отличие от пентозы ДНК, не может вписаться в тесное пространство сахарно-фосфатного остова S-формы. В образовательной Л-форме РНК этот гидроксил направлен наружу и не испытывает никаких стерических ограничений. В процессах транскрипции должен образовываться гибрид РНК-ДНК. Очевидно, для образования такого гибридно рибозо-дезоксирибозного РНК-ДНК дуплекса предпочтительно наличие Л-формы ДНК. Промоторы, или места связывания РНК-полимеров с ДНК в процессе транскрипции, занимают малую долю природной ДНК, находяш ейся в S-форме. Оказалось, что РНК-полимеразы могут, взаимодействуя с ДНК, переводить ее наибольшую часть в Л-конформацию (Иванов В. А., 1972 Жакобо - Молина, 1993). [c.224]

Рис. 10-4. Схема стандартного метода выявления радиоактивно меченных молекул РНК, имеющих определенную нуклеотидную последовательность. В том случае, если молекулы РНК могут образовать гибридный РНК/ДНК дуплекс с од-ноцепочечным фрагментом ДНК, используемым в качестве специфического зонда, эти молекулы остаются неповрежденными в процессе нуклеазной обработки и легко обнаруживаются по радиоактивной метке. В экспериментах, описанных в тексте, очищенные сегменты ДНК. соответствующие разным генам, были получены с помощью клонирования молекул кДНК, которые, в свою очередь, были синтезированы путем обратной транскрипции суммарной мРНК

Рис. 1. Метод РНКазного расщепления. Равномерно меченный одноцепочечный РНК-зонд транскрибируется с клонированной ДНК-матрицы. Зонд смешивают с двухцепочечным тестируемым фрагментом клонированной (геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК, и смесь нагревают для разделения цепей. Проводят отжиг РНК-зонда с комплементарной ему последовательностью в тестируемой ДНК и получают гибридные дуплексы. Если во фрагменте ДНК имеется единичная нуклеотидная замена, то в гибриде РНК—ДНК окажется однонуклеотидный неспаренный участок. Реассоцнированный образец обрабатывают РНКазой А, которая расщепляет цепь РНК по неспаренным участкам. Отметим также, что РНКаза А удаляет выступающие 3 - н 5 концы дуплекса. Дуплекс обрабатывают денатурирующими веществами для разделения цепей, затем проводят электрофорез в денатурирующем (сиквенсном) геле и фрагменты РНК фракционируют по размеру. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Если в тестируемой ДНК нет мутаций, на радиоавтографе наблюдается одна полоса, соответствующая по размеру длине

Рис. 13-5- Строение вспомогательной плазмиды BlueBa His2, используемом конструирования рекомбинантных бакуловирусов Знак с> в дуплексе — инициирующий кодон для синтеза гибридного белка, M S — полилинкер для встраивания целевого гена

Смотреть страницы где упоминается термин Дуплексы гибридные: [c.63] [c.64] [c.243] [c.143] [c.63] [c.64] [c.506] [c.866] [c.890] [c.896] [c.912] [c.987] [c.308] [c.221] [c.222] [c.125] [c.158] [c.277] [c.47] [c.96] [c.179] [c.54] [c.95]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология