Мутагенез с вырожденными праймерами

Рис. 8.6. Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отдельности с помощью ПЦР. Соответствующие праймеры показаны горизонтальными стрелками. Вырожденные олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотиду, не комплементарному соответствующему нуклеотиду в гене-мишени. Амплифици-рованные фрагменты очищают, денатурируют до полного разделения цепей и ренатури-руют. В результате образуются частично двухцепочечные молекулы ДНК, спаренные в области гена-мищени. Их достраивают с помощью ДНК-полимеразы и проводят ПЦР-амплификацию. ПЦР-продукты расщепляют эндонуклеазами рестрикции А и В и встраивают в вектор, обработанный теми же ферментами.

Одной из разновидностей кассетного мутагенеза является способ введения мутаций, основанный на ПЦР с вырожденными праймерами. В этом случае при проведении ПЦР используют праймеры, которые получают введением в определенные положения при их синтезе разных нуклеотидов, что достигается применением на конкретных этапах синтеза не отдельных предшест- [c.323]

Вырожденные праймеры, которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов, содержащих многие точковые мутации, также используют для сканирования определенных участков ДНК [23]. В таком классическом варианте постановки ПЦР, кроме точковых мутаций, можно легко получать делеции и вставки. Дальнейшим усовершенствованием метода направленного мутагенеза с помощью ПЦР явилась разработка подхода к созданию гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеров [24] (рис. 35). Этот метод позволяет не только целенаправленно получать точковые мутации, делеции и встав- [c.295]

Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров [c.163]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология