Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров

Одноцепочечные олигонуклеотиды из -17-24 звеньев используют в качестве праймеров при секвенировании ДНК и проведении ПЦР. [c.86]

С помощью обратной транскриптазы можно синтезировать копию любой части мРИК, выбрав для этого подходящий праймер. Эта возможность облегчает анализ строения какого-либо специфического участка гена. Но можно получить и набор генных фрагментов, если использовать в качестве праймеров произвольные олигонуклеотиды, получаемые, например, в результате гидролиза ДНК тимуса теленка панкреатической ДНКазой. Их разнообразие столь велико, что среди них имеются комплементарные последовательности к любому из участков мРИК (или ДНК). Добавление в реакционную смесь суммарной фракции таких праймеров дает возможность получить в наборе J HK копии всех участков анализируемого гена. Они полезны для использования их в качестве гибридизационных зондов, применяемых для поиска определенных клонов в банках генов (см. гл. 9). [c.182]

Первый метод секвенирования ДНК, предложенный Ф. Сэнгером и А. Коулсоном в 1975 г, основан на ферментативных реакциях и носит название плюс-минус -метод. Данный подход предполагает выделение одноцепочечного фрагмента ДНК, соответствующего исследуемому участку генома. Этот фрагмент используют затем в реакции полимеразного копирования в качестве матрицы, а в качестве праймера — синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые после гидролиза определенными рестриктазами. [c.36]

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. [c.85]

Одноцепочечные олигонуклеотиды используют в качестве праймеров для сайт-специфического мутагенеза in vitro. [c.86]

Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L- и Н-цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ПЦР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5 - и 3 -концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (V и Vjj), легко определить границы DR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих DR грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных праймеров. Каждая пара инициировала синтез ДНК, кодирующей одну из шести DR грызунов три, локализованных на L-цепи, и три - на Н-цепи. Кроме того, на 5 -конце каждого праймера находилось 12 дополнительных нуклеоти- [c.217]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Из результатов, представленных в таблице, становится ясным, что, используя простейший прием включения в реакционную смесь одного короткого праймера со случайной последовательностью, можно с помощью ПЦР амплифицировать конкретную (хотя заранее не определенную) часть генома с неизвестной первичной структурой. При этом сложность образующихся продуктов ПЦР можно контролировать с помощью длины олигонуклеотида, используемого в качестве праймера. Этот метод успешно используется для поиска информативных полиморфных маркеров, пригодных для физического картирования геномов животных и растений, а также идентификации организмов путем получения фингерпринтов их ДНК [315, 316 [c.238]

Благодаря своей высокой эффективности и простоте направленное введение мутаций с использованием олигонуклеотидов по модифицированной методике Т.А. Кункеля до сих пор находит широкое применение [16, 17]. В этом подходе для направленного введения мутаций используют 20-25-звенный олигонуклеотид, комплементарный мутагенизируемому участку гена, который содержит все требуемые замены нуклеотидов. Мутагенизируемый ген или его участок клонируют в фагмидном векторе, в котором далее стандартными методами заменяют ряд остатков тимина на остатки уридина и переводят в одноцепочечную форму. Олигонуклеотид гибридизуют с такой кольцевой одноцепочечной ДНК и используют в качестве праймера для модифицированной Т7-ДНК-полимеразы (секвеназы), с помощью которой в присутствии обычных четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов синтезируют комплементарную цепь ДНК (рис. 33). [c.290]

В 1978 г. было опубликовано две работы [21, 38], показавшие, каким образом с помощью олигонуклеотидов можно осуществлять прецизионные изменения в структуре ДНК. В обеих работах мутациям подвергался геном бактериофага ФХ174. В зрелом вирусе ДНК этого фага находится в одноцепочечной форме, но при инфицировании перед образованием новых фагов превращается в двухцепочечную, или репликативную, форму (RF). Авторы [21, 38] использовали синтетические олигонуклеотиды, комплементарные к вирусной ( + ) цепи, в качестве праймеров для синтеза in vitro [c.102]

В 1978-1979 гг. С. Джиллам и М. Смит с соавторами экспериментально обосновали возможность использования синтетических олигонуклеотидов в качестве мутагенов (рис. 6.10, а). Объектом мутагенеза авторы выбрали фаг 0X174, имеющий небольшую одноцепочечную кольцевую ДНК, для которой уже была известна последовательность нуклеотидов. Одноцепочечную кольцевую ДНК гибридизовали с синтетическим олигонуклеотидом, имевшим определенные отличия от соответствующей последовательности фагового генома, например точечную замену одного из нуклеотидов. Данный олигонуклеотид использовали в качестве праймера для достройки второй цепи на ДНК- [c.180]

Внимательный читатель скорее всего заметил, что в ходе написания данной статьи авторы волей-неволей концентрировали свое внимание на различных аспектах применения ПЦР и неразрывно связанных с этим могцным методом олигонуклеотидных праймеров. Однако сделанное чуть выгпе описание отдельных наноструктур и наномеханических устройств показало, что олигонуклеотиды используются не только в качестве затравок при ферментативном построении новых цепей ДНК, а также в клонировании и секвенировании. Другое оригинальное применение олигонуклеотидов связано с их использованием в качестве фармацевтических препаратов. [c.64]

Для флуоресцентного детектирования олигонуклеотидов наибольшее применение находит метод, основанный на использовании люминесцентных праймеров ДНК [14], образующихся при нуклеофильной атаке свободной аминогруппой 5 -аминоолигонуклеотида элекгрофильного центра люминофора. В качестве последнего используют молекулы с шестью и более сопряженными ненасыщенными связями, обычно содержащие фенильный фрагмент с нуклеофильно подвижным атомом галогена. Одним из таких люминофоров является 7-фтор-4-нитробенз-2-окса-1,3-диазол [c.39]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

Смотреть страницы где упоминается термин Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров: [c.282] [c.74] [c.78] [c.302] [c.411] [c.27] [c.20] [c.20] [c.205] [c.140] [c.140] [c.158] [c.160] [c.214] [c.59] [c.283] [c.314] [c.316] [c.312]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология