Эндонуклеазы рестрикции

В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]

Рис. 8.6. Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отдельности с помощью ПЦР. Соответствующие праймеры показаны горизонтальными стрелками. Вырожденные олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотиду, не комплементарному соответствующему нуклеотиду в гене-мишени. Амплифици-рованные фрагменты очищают, денатурируют до полного разделения цепей и ренатури-руют. В результате образуются частично двухцепочечные молекулы ДНК, спаренные в области гена-мищени. Их достраивают с помощью ДНК-полимеразы и проводят ПЦР-амплификацию. ПЦР-продукты расщепляют эндонуклеазами рестрикции А и В и встраивают в вектор, обработанный теми же ферментами.

Широкое распространение обмена ДНК между бактериями ставит перед ними задачу сохранения собственного генома. Далеко не всегда проникшая в клетку чужеродная ДНК.способна оказаться полезной. Более того, посторонний генетический материал может быть губительным для клетки, особенно если принадлежит бактериальному вирусу, бактериофагу. Для того чтобы бороться с чужеродной ДНК, нужно уметь отличать свою ДНК от чужой. Бактерии достигают этого те.м, что метят свою ДНК с помощью специального модифицирующего фермента. Практически все виды бактерий имеют метилазы, модифицирующие аденин или цитозин в определенной, характерной для данного вида последовательности ДНК- Другой специальный фермент, эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза), узнает ту же последовательность и разрезает ее, если она не модифицирована, т. е. попала в клетку извне. Таким путем бактерии ограничивают возможности попадания в них постороннего генетического материала. [c.129]

Что такое эндонуклеазы рестрикции типа II и почему они так важны для технологии рекомбинантных ДНК [c.79]

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]

Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции. [c.117]

Обработка двумя эндонуклеазами рестрикции [c.167]

Один из подходов к решению проблемы деградации хозяйской ДНК гетерологичными эндонуклеазами рестрикции состоит в клонировании и экспрессии в реципиентном организме как гена фермента рестрикции, так и гена соответствующего модифицирующего фермента. Однако клонирование обоих этих генов в одном микроорганизме технически затруднено, если они расположены на хромосоме донорного организма далеко друг от друга. Кроме того, чтобы не допустить расщепления хозяйской ДНК эндонуклеазами рестрикции, метилирующий фермент после трансформации должен синтезироваться еще до начала синтеза рестриктазы. [c.248]

Создают банк клонов ДНК организма-доно-ра, продуцирующего известную эндонуклеазу рестрикции. Используемый при этом плазмидный вектор должен содержать по крайней мере один сайт узнавания для этой рестриктазы. [c.248]

Обрабатывают ее интересующей исследователя эндонуклеазой рестрикции. [c.248]

Трансформируют Е. соИ плазмидными ДНК, обработанными эндонуклеазой рестрикции. [c.248]

Ключевым моментом этого метода является то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы. [c.248]

Опишите стратегию выделения гена эндонуклеазы рестрикции ЕсоШ. [c.274]

В экспрессирующую плазмиду встроен ген, в котором сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции ЕсоШ начинается с G, входящего в триплет первого метионина. Встройте в этот белок дополнительный трипептид. Какие ограничения налагаются на строение этого трипептида [c.198]

Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК. [c.276]

Частоту появления рекомбинантных бакуловирусов удалось повысить с менее чем 1% до 99%. Для этого ДНК A MNPV обрабатывали эндонуклеазой рестрикции, которая расщепляла ДНК в двух специфичных сайтах с высвобождением фрагмента, несущего часть гена, необходимого для осуществления литического цикла. Клетки насекомого трансфицировали этим фрагментом, а затем — транспортным вектором. В результате двойного кроссинговера в некоторых клетках восстанавливался кольцевой геном A MNPV, который содержал клонированный ген и функциональный ген, необходимый для осуществления литического цикла. В результате почти все вирулентные бакуловирусы оказывались рекомбинантными. [c.155]

Рис. 8.9. Генноинженерная конструкция, кодирующая рекомби-ниншый белок цинковые пальцы — эндонуклеаза рестрикции Fold .

Бактерии, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, защищают собственную ДНК от расщепления с помощью ферментов, метилирующих те участки молекулы, с которыми связывается соответствующая эндонуклеаза рестрикции. Однако геном клетки-хозяина не защищен от рекомбинантной рестриктазы Fokl, и чтобы предотвратить гибель растущих клеток, синтез гибридного фермента подавляли, поместив ее ген под контроль системы экспрессии бактериофага Т7. [c.174]

В результате этих экспериментов были получены две рекомбинантные эндонуклеазы рестрикции Fokl. Одна из них расщепляла ДНК фага X в том сайте, который и ожидался, а вторая -в ожидаемом сайте и - в меньшей степени - в двух других сайтах. Это не удивительно, поскольку цинковые пальцы распознают в основном два из трех оснований триплета. Хотя эти рекомбинантные ферменты пока нельзя использовать в лаборатории, описанный подход создания уникальньгх эндонуклеаз рестрикции представляется весьма перспективным. [c.174]

Развитие технологии рекомбинантных ДНК было бы невозможно, если бы в распоряжении исследователей не было нужных эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). В настоящее время в продаже имеется более 300 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируются самыми разными микроорганизмами аэробными, анаэробными, фотосинтезирующими, диазотрофными. [c.247]

Технология выделения и экспрессии чужеродных генов в Е. соН и в некоторых других микроорганизмах достаточно хорошо отработана, однако не стоит забывать, что синтез гетерологичного белка в организме-хозяине может оказывать на него негативное влияние. Например, сверхпродукция такого белка может привести к истощению метаболических ресурсов хозяйского организма и отрицательно повлиять на его рост. Присутствие гетерологичного белка может оказаться даже губительным для клетки-хозяина. Так, сайты рестрикции имеются во всех молекулах ДНК, и если продуктом клонированного гена является эндонуклеаза рестрикции, то в отсутствие специальных защитных механизмов хозяйская ДНК будет расщепляться ею. [c.247]

Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты эндонуклеазы рестриьщии у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной. [c.248]

Как следует изменить нуклеотидную последовательность ДНК, чтобы, сохранив аминокислотную последовательность, удалить сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BamHl Считайте, что первый нуклеотид сайта узнавания совпадает с первым нуклеотидом кодона. Каким методом это можно осуществить [c.198]

Эти ферменты известны под общим названием эндонуклеазы рестрикции. Термин эндонуклеаза означает, что фермент катализирует расщепление нуклеиновой кислоты по внутренним фосфодиэфирным связям в отличие от зкзонуклеаз, катализирующих отщепление концевых звеньев нуклеиновой кислоты (к их числу относится упоминавшаяся в 7.3 фосфодиэстераза из змеиных ядов). Сокращенно эндонуклеазы рестрикции называют рестриктазами. В табл. 7.5 перечислены некоторые из наиболее широко используемых при изучении структуры ДНК и других биохимических исследованиях рестриктазы. [c.276]

Чтобы встроить ген в 1юльцевую плазмиду, последнюю превращают в линейную двунитевую ДНК обработкой какой-либо эндонуклеазой рестрикции (см. [c.301]

Сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции Ват Н1 имеет последовательность GGAT , которая кодирует дипептид Glj—Ser. Для того чтобы нарушить сайт узнавания, достаточно заменить один из нуклеотидов. Учитывая, что Gly кодируется четырьмя, кодонами GGN, а Ser — кодоном U N, где N - любой из четырех нуклеотидов, то достаточно [c.444]

Так как необходимо ввести липкие концы в фрагмент ДНК, который вставляется по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции E oRl, то первым аминокислотным остатком должен быть Asn (кодон AAU). Кодон второго аминокислотного остатка должен начинаться на и, т.е. это могут бьггь Phe, Leu, Ser, Tyr, ys, Trp. И лишь третий аминокислотный остаток может быть любым. [c.445]

Сайт-специфичные дезоксирибонуклеазы Эндонуклеолитическое расщепление (эндонуклеазы рестрикции) ДНК с образованием специфичных [c.458]

В качестве примера рассмотрим один из них. В его основу были положены модульный принцип конструирования ДНК и использование временных сайтов уникальных эндонуклеаз рестрикции для последовательного клонирования отдельных фрагментов и сборки целевого полинуклеотида. Дополнительные рест[ 1ктные сайты вводятся в последовательность гена в произвольно выбранные места. [c.373]

Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (1990) -- [ c.0 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.0 ]

Биологическая химия (2002) -- [ c.276 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.73 , c.74 , c.413 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.73 , c.74 , c.413 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.0 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология