Мутагенез кассетный

Рассмотренные подходы к получению сайт-специфических мутаций с помощью олигонуклеотидов позволяют с высокой точностью и эффективностью производить замены отдельных нуклеотидов в строго определенных локусах. Однако чаще всего невозможно предсказать фенотипические последствия мутационных замен отдельных аминокислот в полипептидных цепях белков, и для получения необходимых фенотипических изменений требуется внесение множественных мутаций в определенные участки гена с последующим отбором мутантов требуемого фенотипа. Для решения подобных задач был разработан и эффективно используется метод кассетного мутагенеза. [c.323]

Одной из разновидностей кассетного мутагенеза является способ введения мутаций, основанный на ПЦР с вырожденными праймерами. В этом случае при проведении ПЦР используют праймеры, которые получают введением в определенные положения при их синтезе разных нуклеотидов, что достигается применением на конкретных этапах синтеза не отдельных предшест- [c.323]

При реализации такого подхода из гена, клонированного в составе векторной плазмиды, по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который требуется внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонук-леотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на некоторых этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно определять функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами. [c.323]

Аналогичный подход был использован для получения гена, кодирующего бактериородоп-син (bR). Целевой ген, спроектированный для кассетного мутагенеза, бьш разделен на 3 фрагмента и содержал в своем составе 33 уникальных сайта. Каждый из фрагментов разбивали на полинуклеотиды длиной от 70 до 100 звеньев [c.75]

В целях расширения возможностей создания нового поколения живых вакцин К. Барк с соавторами сконстр)Т1ровали плазмиду p ASl, названную кассетным вектором. В составе плазмиды p ASl, содержащей полную ДНК-копию генома полиовируса под контролем промотора фага Т7, олигонуклеотид-направленным мутагенезом в область, кодирующую АД1, введены участки гидролиза рестриктазами San и Dra (рис. 17.1). Сегмент ДНК, ог- [c.437]

Кассетный мутагенез. Участок, в который мы хотим внести мутацию, вырезают из клонированного рекомбинантного вектора по двум фланкмрующим уникальным рестрикционным сайтам и вместо него включают синтетический дуплексный олигонуклеотид, содержа- [c.349]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология