Случайный мутагенез

Рис. 8.6. Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отдельности с помощью ПЦР. Соответствующие праймеры показаны горизонтальными стрелками. Вырожденные олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотиду, не комплементарному соответствующему нуклеотиду в гене-мишени. Амплифици-рованные фрагменты очищают, денатурируют до полного разделения цепей и ренатури-руют. В результате образуются частично двухцепочечные молекулы ДНК, спаренные в области гена-мищени. Их достраивают с помощью ДНК-полимеразы и проводят ПЦР-амплификацию. ПЦР-продукты расщепляют эндонуклеазами рестрикции А и В и встраивают в вектор, обработанный теми же ферментами.

Случайный мутагенез с использованием аналогов нуклеотидов [c.166]

В первом томе монографии рассмотрены современные методические подходы, используемые в генной и белковой инженерии для создания рекомбинантных ДНК и белков. Вначале обсуждаются основные принципы и методы генной инженерии, включая клонирование ДНК, создание клонотек нуклеотидных последовательностей и систем их экспрессии. Отдельная глава посвящена ПЦР и альтернативным способам амплификации ДНК. Во второй части описаны принципы методов, используемых при реализации двух основных направлений белковой инженерии рационального дизайна и направленной эволюции белковых молекул, в том числе, направленного и случайного мутагенеза, лигиро-вания синтезированных белков, фагового и рибосомного дисплеев и т.п. [c.4]

Умение индуцировать мутации в клонированных генах с целью получения мутантных белков лежит в основе белковой инженерии. При этом используют две группы методов, приводящих к разным последствиям на молекулярном уровне. Первая группа основана на случайном мутагенезе, т.е. введении в мутагенизиру-емый участок гена многих мутаций, положение каждой из которых не контролируется исследователем, а ограничивается лишь размером фрагмента нуклеиновой кислоты, в который эти мутации вводятся. Более или менее случайный мутагенез имеет место, в частности, при инкубации нуклеиновых кислот с химическими мутагенами или осуществлении их синтеза с помощью ДНК-полимераз с ослабленной специфичностью в отношении субстра-тов-предшественников. Совокупность этих подходов активно используется при проведении направленной эволюции белковых молекул. Вторая группа методов, получившая название направленного или сайт-специфического мутагенеза, обеспечивает введение мутаций в строго определенные участки нуклеиновых кислот, что позволяет заменять отдельные аминокислотные остатки в кодируемых этими молекулами белках и ферментах. Направленный мутагенез является сердцем (но не мозгом) рационального дизайна и редизайна белковых молекул, к рассмотрению которого мы сейчас переходим. [c.278]

Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров [c.163]

Рациональный дизайн и случайный мутагенез [c.458]

Помимо описанного выще, для случайного мутагенеза используют и другие методы, например один из вариантов олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с применением ДНК фага М13. В этом случае затравкой для синтеза ДНК служит смесь олигонуклеотидов, содержащих случайные замены. В результате получают библиотеки клонов, несущих множество мутаций в различных сайтах. Недостаток подходов, при которых в клонированном гене образуется больщое число случайных мутаций, состоит в необходимости тестирования каждого клона для идентификации того, который детерминировал бы синтез нужного белка. Это весьма непростая [c.167]

Далее для повышения стабильности субтили-зина без кальцийсвязывающего домена идентифицировали сайты, которые необходимо изменить, и аминокислотные остатки, которые нужно ввести в эти сайты. Было высказано предположение, что все аминокислоты, взаимо-действуюшие с кальцийсвязывающим доменом в исходном ферменте, не являются оптимальными в новых условиях. В качестве кандидатов были выбраны 10 аминокислот, а поскольку заранее не было известно, включение какого именно аминокислотного остатка приведет к наибольшей стабилизации фермента, для внесения изменений в каждый из 10 сайтов использовали случайный мутагенез. [c.173]

Поскольку большинство изменений аминокислотных остатков в составе полипептидных цепей проводится в искусственных генетических системах с использованием направленного или случайного мутагенеза, целесообразно в конце этого краткого введения вспомнить типы мутаций и их основные характеристики. [c.276]

В целом, химические модификации представляют собой группу быстро реализуемых и недорогих методов стабилизации ферментов и изменения их субстратной специфичности путем введения небольших функциональных групп, что невозможно сделать с помощью направленного и случайного мутагенеза. К недостаткам этих методов следует отнести невозможность осуществления контроля за полнотой прохождения реакций и изменения конкретных участков полипептидных цепей. Решение проблемы лежит на пути комбинированного применения направленного мутагенеза с последующей химической модификацией боковых цепей [c.371]

Как видим, сегмент-направленный статистический (случайный) мутагенез можно осуществлять альтернативными методами. Получающийся при этом широкий спектр мутантов позволяет проводить исследование структурно-функциональной организации изучаемого локуса. Недостатки данного подхода состоят в том, что с его помощью сложно получить мутант со строго определенными заменами нуклеотидов и нельзя ввести в ДНК заранее запланированные делеции и вставки. Эти возможности обеспечивает олигонуклеотид-направленный (сайтспецифический) мутагенез- [c.180]

Идеи С. Спигельмана оказались исключительно продуктивными для последующего развития молекулярной биологии и легли в основу одного из ключевых подходов к получению новых белков и ферментов с использованием методов направленной эволюции макромолекул. Однако, в отличие от обсуждавшихся выше классических опытов, разнообразие последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, эволюционирующие in vitro в такой системе, возникает не спонтанно, а создается исследователем с помощью случайного мутагенеза перед каждым новым раундом отбора белков с требуемыми свойствами. Поэтому эксперименты по направленной эволюции белков начинаются с формирования комбинаторных клонотек случайных последовательностей, которые охватывают определенную часть исследуемого пространства последовательностей. [c.321]

Получение клонотек случайных последовательностей и их направленную эволюцию проводят в два этапа 1) исследуемую последовательность нуклеотидов подвергают случайному мутагенезу и отбору на основании свойств кодируемого этой последовательностью белка, 2) популяцию отобранных последовательностей фрагментируют случайным образом с помощью ДНКазы I а) или методом ПЦР с короткими случайно отжигающимися праймерами (б) и перекрывающиеся фрагменты объединяют друг с другом с помощью ПЦР без праймеров образовавшимися в итоге полноразмерными молекулами ДНК трансформируют компетентные клетки, среди которых проводят отбор по фенотипу на основании свойств исследуемого рекомбинантного белка [c.329]

Конструирование ферментов методами белковой инженерии сопровождается постепенным освоением новых областей исследуемого пространства последовательностей и на зтом пути продвижения в неведомое наблюдается значительный прогресс (рис. 59). Методы классического скрининга белков с новыми свойствами, основанные на последовательном переборе отдельных различающихся последовательностей, дают возможность исследовать лишь очень ограниченное количество не связанных друг с другом представителей из теоретически доступного пространства последовательностей в разных его областях. Картина изменяется лишь незначительно при анализе большого количества геномов разных видов в процессе метагеномного скрининга. Методы направленного и случайного мутагенеза позволяют незначительно отклониться от исходной последовательнбсти и исследовать пространство последовательностей в ее окрестностях. Случайное объединение доменов разных белков и, особенно, комбинаторная перетасовка нуклеотидных последовательностей разных геномов дают возможность обследовать брлее удаленные друг от друга области пространства последовательностей. Тем не менее, наши современные возможности пока не позволяют подойти к решению этой проблемы более широко, и в исследуемом [c.460]

В случаях, когда известно, какую аминокислоту надо заменить, но не ясно — на какую, применяют метод случайного мутагенеза данного кодона (Reidhaar-Olson, Sauer, 1988), как это описано в гл. 8. [c.443]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология