Метод гибридизации ДНК-ДНК с использованием нитроцеллюлозных фильтров

Метод гибридизации ДНК-ДНК с использованием нитроцеллюлозных фильтров [c.109]

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации. С этой целью бактериальные колонии выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой. Далее приготовляют реплики к фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцел-люлозный фильтр, который затем переносят на чашку Петри с плотной питательной средой, где образуются колонии, идентичные первым. [c.121]

После того как обработанная рестриктазами ДНК разделена путем электрофореза в агарозном геле, следующий эта заключается в переносе (блоттинге) разделенных фрагментов-ДНК на соответствующий фильтр. Впервые метод блоттинга-описан Саузерном [7]. Незначительно видоизменив сам метод многих лабораториях заменили нитроцеллюлозный фильтр, используемый в оригинальной методике, на более прочные-найлоновые фильтры. Кроме того, что они более прочные, эти-фильтры повышают чувствительность гибридизации и их можно использовать многократно, причем чувствительность пр этом не снижается (см. примечание ж в разд. 5.5.3). В любом случае ДНК необходимо вначале перенести с геля на подложку. Фрагменты ДНК большего размера обычно переносятся неочень эффективно, и в связи с этим ДНК частично апуринизи-руют, обрабатывая кислотой, чтобы раздробить молекулы-ДНК на фрагменты меньших размеров [9]. Затем ДНК в геле-денатурируют in situ, обрабатывая концентрированной щелочью, и перед переносом нейтрализуют, чтобы не повредить, фильтр. В результате этого процесса ДНК становится одноцепочечной. При использовании нитроцеллюлозных, но не найло-новых фильтров это абсолютно необходимо для закрепления ДНК и вне зависимости от типа подложки обеспечивает эффективность гибридизации. С появлением найлоновых подложек изменился и традиционный метод капиллярного переноса, разработанный Саузерном. Данный метод в настоящее время можно заменить электропереносом, который гораздо быстрее капиллярного (1—2 ч по сравнению с 12—16 ч), но приводит к некоторому снижению чувствительности [4]. После переноса ДНК должна быть зафиксирована на фильтре. В оригинальном методе Саузерна это осуществляется путем прогревания нитроцеллюлозного фильтра в течение нескольких часов-при 80°С. Для найлоновых мембран данная процедура заменена ультрафиолетовой сшивкой, что занимает несколько минут. Сшивка ультрафиолетом главным образом приводит к повышению чувствительности найлоновых фильтров, а также повышает-и чувствительность гибридизации на обычной нитроцеллюлозе-[4]. К сожалению, на практике эта стадия вызывает некоторые затруднения, поскольку неизвестно, какая доза ультрафиолетового облучения требуется для каждого из известных в настоящее время типов найлоновых фильтров. В связи с этим в- [c.287]

Отсюда можно извлечь один урок. Нитроцеллюлозные мембраны, использованные для изучения гибридизации нуклеиновых кислот, были изобретены вовсе не для этой цели. Они долгие годы применялись для других целей и, к счастью, оказались доступными в тот момент, когда исследователи искали новые подходы к этой проблеме. Никакого систематического изучения мембран для гибридизации нуклеиновых кислот проведено не было. Возможно, существуют мембраны, которые лучше подходят для этой цели. К сожалению, выпуск мембранных фильтров — процесс настолько сложный, что исследователи, стремящиеся улучшить соответствующие методы, находятся в полной зависимости от производителей мембран. Вряд ли такое положение можно назвать удовлеворительным. Идеальный путь разработки новых методов состоит в том, чтобы исключить частнособственнические соображения. Торговые интересы должны вступать в силу лишь после того, как метод [c.331]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология