Электрофорез в денатурирующих гелях

Рис. 7. Приготовление перпендикулярно-градиентного денатурирующего геля. А. Расположение стеклянных пластин и спейсеров. Левый рисунок представляет собой вид спереди стеклянных пластин со вставленными спейсерами для электрофореза. Обратите внимание, что передняя пластина имеет форму прямоугольника (без ушек ), а задняя пластина имеет ушки . Левый боковой спейсер помещается между пластинами так, что между ним и основанием геля образуется зазор в 3—4 см. Правый спейсер располагается между плас-стииами от вершины до самого основания геля. Верхний спейсер вставлен на 1 см ниже пластины с ушками и плотно пригнан к боковым спейсерам. Место соединения верхнего и правого бокового спейсеров смазывают небольшим количеством вакуумной смазки. Правый рисунок представляет собой вид пластин сзади. Б. Соединенные пластины и аппарат для электрофореза. Собранные пластины и спейсеры закрепляют в аппарате для электрофореза основание и правую сторону пластин заливают расплавленной агарозой. Дно заполняют, наливая 50 мл агарозы в кювету, в которой крепятся пластины. После застывания агарозы аппарат для электрофореза переворачивают на правую сторону и через отверстие в нем и зазор с левой стороны заливают

Как и в случае нуклеиновых кислот, электрофорез в геле — лучший метод определения типов и размеров капсидных белков. Перед электрофорезом белки денатурируют ДДС-Ыа, устраняя тем самым большинство проблем, вызываемых различиями удельных зарядов неденатурированных белков. Методы денатурации и гель-электрофореза белков описаны в руководстве [16]. Особое внимание следует обратить на методы обнаружения нетипичной миграции денатурированных ДДС-Ыа белков в геле (графики Фергюсона). Ниже описана быстрая методика диссоциации вирусных частиц и получения нуклеиновых кислот и белков для гель-электрофореза. [c.41]

Рис. 9. Гели для оптимизации продолжительности электрофореза (оптимизирующие гели). На каждом рисунке показаны результаты, полученные в параллельно-градиентных денатурирующих гелях с нанесением образцов через определенные промежутки времени. Такие оптимизирующие гели дают представление об оптимальной продолжительности электрофореза, проводимого с целью максимального разделения мутантного фрагмента ДНК и фрагмента ДНК дикого типа. А. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, не претерпевшим заметных изменений подвижности по достижении участка с концентрацией денатурирующего вещества, соответствующей температуре плавления первого домена. Расстояние между вершиной и основанием геля измерено линейкой. Полученная информация используется для определения участка геля, соответствующего Гт первого домена плавления. Это значение в свою очередь было предварительно установлено в перпендикулярно-градиентном электрофорезе. Промежуток времени, за который фрагмент достигнет данного участка, считается минимальной продолжительностью проведения последующих электрофорезов. Обычно для получения оптимальных результатов к этому времени прибавляют еще 1—2 ч. Б. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, резко изменившим подвижность при плавлении первого домена. Электрофорез в течение 12 ч (лунка 1), 10 ч (лунка 2), 8 ч (лунка 3), 6 ч (лунка 4), 4 ч (лунка 5) и 2 ч (лунка 6). Через восемь часов прохождения через гель, когда начинается процесс плавления, фрагмент замедляет движение. Оптимальное время для последующих электрофорезов этого фрагмента — 9— 10 ч. В. Оптимизирующий гель с мутантными фрагментами и фрагментами дикого типа. Если имеется известный мутантный фрагмент, то гели такого типа можно использовать для эмпирического определения оптимального времени электрофореза. Это время, за которое достигается максимальное разделение утан иого фрагмента и рагмента дикого типа.

Электрофорез в денатурирующем геле, содержащем ДСН, обычно проводят прн комнатной температуре. [c.352]

Анализ меченых фрагментов РНК при помощи денатурирующего гель-электрофореза с последующей радиоавтографией. В этом случае эффективное расщепление по неспаренным основаниям приводит к появлению на радиоавтографах двух [c.124]

Разделение при помощи препаративного денатурирующего гель-электрофореза [c.168]

Загрузите 10 мкл образца в лунку параллельно-градиентного денатурирующего геля и проводите электрофорез, как описано в разд. 6.2.2. [c.174]

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ДЕНАТУРИРУЮЩИХ ГЕЛЯХ [c.128]

Воспроизводимое фракционирование однонитевых молекул ДНК и РНК, а также определение их молекулярной массы по скорости миграции в геле оказываются возможными только при сохранении условий денатурации в ходе самого электрофореза. Поэтому во всех случаях, когда нет необходимости сохранить нативную структуру, нуклеиновые кислоты предпочитают фракционировать электрофорезом в денатурирующих условиях, или, как говорят, в денатурирующих гелях. Это означает, что внутри геля создается среда, препятствующая комплементарному спариванию одинарных нитей нуклеиновых кислот или их участков. [c.129]

В некоторых случаях эта среда способствует распрямлению нитей, что делает зависимость скоростей миграции от значений длины полинуклеотидов более строгой, обеспечивает возможность их тонкого фракционирования и оценки молекулярной массы (сопоставлением с маркерами). Рассмотрим различные варианты электрофореза в денатурирующих гелях и их использование. [c.129]

Электрофорез совокупности таких фрагментов в денатурирующем геле (с мочевиной) дает серию полос, своеобразную лестницу , выявляемую методом авторадиографии. Для четырех разных химических обработок получается четыре различные лестницы . Электрофорез проводят в параллельных треках на одной пластине геля и сравнивают получающиеся в них картины. Перекладины (полосы) одной лестницы будут располагаться между полосами других, в соответствии с последовательностью расположения нуклеотидов в нити ДНК. Сопоставляя одновременно все четыре лестницы и зная специфику каждого из четырех методов расщепления, можно установить всю последовательность нуклеотидов в ДНК — прочитать ее на авторадиографическом снимке геля. [c.132]

Преимущества электрофореза в градиенте пористости (концентрации) ПААГ были отмечены в предыдущем разделе при обсуждении фракционирования белков. По-видимому, нет оснований предполагать, что эти преимущества не будут ощутимы и при фракционировании нуклеиновых кислот. Вероятно, лучших результатов можно ожидать в денатурирующих гелях, поскольку гибкость нитей нативных нуклеиновых кислот в обычных гелях может смазывать эффект торможения полос при уменьшении размера пор. [c.142]

Химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую фуппу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Метод заключается в электрофорезе двухцепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле. [c.37]

Оптимальными, на наш взгляд, являются РНК-зонды и соответственно исследуемые на однонуклеотидные замены участки ДНК длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. В этом случае и сам зонд, и продукты его расщепления легко выявляются при помощи денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, аналогичном используемому при секвенировании ДНК. При этом отношение сигнала к фону достаточно высоко для получения четких результатов. Совсем нетрудно наработать меченые одноцепочечные РНК-зонды гораздо большей длины, но результаты обработки таких длинных цепей РНКазой неоднозначны. Еще одна проблема, которая возникает при использовании зондов с длиной цепи более 1000 п. н., заключается в том, что под действием РНКазы наряду с расщеплением РНК—ДНК-дуплексов по неспаренным участкам может происходить (хотя и редко) расщепление цепи РНК по комплементарно спаренным участкам дуплекса. Кроме того, анализ продуктов расщепления длинных РНК-зондов (>-1000 п.н.) требует проведения денатурирующе- [c.127]

Установку и нагревательную систему, пригодные для ДГГЭ,. можно получить из разных источников либо приобрести у фирм-производителей, либо изготовить по эскизам, приведенным в ссылках [20] и [28]. Все оборудование, необходимое для проведения денатурирующего гель-электрофореза, или отдельные его части можно приобрести у следующих фирм [c.154]

А. Перпендикулярно-градиентный денатурирующий гель с фрагментом ДНК длиной 450 п. н., имеющим два домена плавления. Резкое изменение подвижности фрагмента в середине геля происходит в результате плавления его первого домена при концентрации денатурирующего вещества 60%. Температуру плавления этого домена можно определить, установив параметры точки перегиба этого участка. Исходя из по.иученных данных, параллельно-градиентный денатурирующий электрофорез такого фрагмента следует проводить в геле с концентрациями денатурирующих факторов от 47,5% до 72,5%. Б. Перпендикулярно-градиентный денатурирующий гель с фрагментом ДНК длиной 450 п. п., имеющим три домена плавления. На рясунке видны две области изменения подвижности. Левая, с концентрацией денатурирующего вещества 35%, образуется при плавлении первого домена. Правая образуется в результате плавления второго домепа при концентрации денатурирующего вещества [c.161]

Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности (специфичность праймера) и 2) способом получения образца, приемлемого для секвенирования. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод (Максама — Гилберта). Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть [12]. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель [15]. [c.185]

Следует отм1етить, что в этой методике описано приготовление неденатурирующего геля для проведения электрофореза на холоду (4°С), чтобы свести к минимуму потерю ферментативной активности фракционируемых белков. Тот же метод можно использовать для приготовления денатурирующего геля, если в смесь для геля добавить 1 %-ный ДСН. Электрофорез в денатурирующем геле обычно проводят при комнатной температуре. Во время работы следует надевать резиновые перчатки, поскольку акриламид представляет собой нейротоксин с кумулятивным действием и особенно опасен в виде мономера. [c.350]

Активность GUS можно выявить in situ среди фракционированных белков после денатурирующего гель-электрофореза экстрактов. Такой подход помогает изучать белки, образующиеся в результате трансляционного слияния, а также посттрансля-ционный процессинг белков, например отщепление транзитных пептидов после переноса продукта химерного гена ab-GUS в хлоропласты. Аналогичный анализ химерного гена РБФК M -npt-II описан в разд. 6.7, в котором и приведены более подробные детали приготовления и проведения электрофореза в ПААГ. [c.371]

В качестве рабочего буфера геля использовали 0,1 М Na-фосфат (pH 7) с и,1% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфёре, но содержащем 0,5% цетавлона и 10—15% i -меркаптоэтанола. Лидирующий краситель — малахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на трубку (10X0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,57о-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% этанола, в течение 10 ч. [c.86]

Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3%-ный денатурирующий гель (С=11) для электрофореза РНК можно готовить на 65%-ном водном формамиде [Bean et al.. [c.137]

В одной недавней работе [Rave et al., 1979] был описан электрофорез поли (А)-РНК в денатурирующем геле агарозы, содержащем 67о формальдегида в 0,04 М Na-фосфатном буфере. РНК перед нанесением на гель денатурировали в 50%-ном растворе формамида с 6% формальдегида в том же буфере при 60 в течение 5 мин. Затем препарат быстро охлаждали и добавляли в него, как обычно, глицерин и бромфеноловый синий. В электродные резервуары заливали такой же буфер, содержащий 3% формальдегида. После окончания электрофореза гель вымачивали в течение 5 мин в воде при 60 . Этого было достаточно для снятия формальдегида с РНК, которую затем, после частичного щелочного гидролиза, переводили диффузией из геля на диазобумагу по методу Олвина [Alwine et al., 1977]. Несмотря на предшествующую обработку формальдегидом, поли (А)-РНК на диазобумаге успешно гибридизуется с ДНК. [c.139]

В некоторых случаях в результате электрофореза в геле и процедуры блоттинга антиген денатурирует так, что некоторые из его эпитопов разрушаются и теряют способность связываться [c.531]

Различные фрагменты линейной ДНК сначала специфически метили на 5 -конце слева (5 L) и на 5 -конце справа (5 R), а также на З -конце слева (3 L) и на З -конце справа (3 R). Затем препарат каждого фрагмента инкубировали в буфере, содержащем re B D-белок. В качестве контроля отдельную пробу меченой ДНК инкубировали в буфере без re B D. Инкубация длилась 1 ч. После этого ДНК денатурировали кипячением и образовавшиеся одиночные цепи разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Распределение радиоактивно меченных фрагментов ДНК показано на рис. 5-25. В качестве дополнительного контроля образец 3 R, инкубированный с re B D, был подвергнут электрофорезу в геле без предварительной денатурации (рис. 5-25). [c.29]

Первый этап анализа связан с идентификацией этого гена в суммарной человеческой ДНК. Для этого ДНК выделяют из клеток, с помощью эндонуклеаз получают фрагменты, раздечяют их в агарозе с помощью гель-электрофореза, денатурируют на две отдельные цепи и создают реплику с препарата на питроцеллюлозном фильтре. Следующий шаг состоит в том, чтобы найти среди всех фрагментов р-глобиновый ген. Для этого необходим радиоактивный ДНК-зонд. Его синтезируют на р-глобиновой РНК с помощью обратной транскриптазы. Далее этот к-ДНК зонд используют для двух задач. Первое — идентифицировать фрагменты [c.70]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология