Бактериальные колонии, скрининг

Скрининг бактериальных (или дрожжевых) колоний, основанный на гибридизации соответствующей ДНК со специфическим Р-меченным зондом. Нужную вставку содержат две колонии, 1 и 6. [c.293]

Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов - РНК, белков или ферментативной активности, т.е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например, цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует самую высокую эффективность, так как позволяет в одно касание освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов. [c.162]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

Скрининг библиотек. После того как радиоактивный зонд получен, просматривают геномную библиотеку или библиотеку кДНК для идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с последовательностью, комплементарной зонду и, следовательно, соответствующей анализируемому белку. [c.46]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Улучшенный скрининг становится возможным в том случае, если объекты, составляющие клонотеку, различаются фенотипически, например, по наличию у них потенциальной ферментативной активности. Примером улучшенного скрининга является обнаружение окрашенных бактериальных колоний, что может быть следствием экспрессии в бактериальных клетках искомого фермента. Хотя при таком качественном тесте все равно приходится анализировать все объекты клонотеки, которые будут затеряны среди ненужных представителей (в нашем примере -большого числа неокрашенных бактериальных клеток), улучшенный скрининг существенно облегчает процесс поиска требуемых молекулярных объектов. Тем не менее, эта группа методов, как правило, характеризуется низкими значениями отношения сигнала к шуму, а также имеет место конкуренция (в том числе и неспецифическая) за ресурсы (в частности, компоненты питательной среды или субстрат реакции) со стороны ненужных компонентов клонотеки, что может блокировать проявление фенотипического признака. [c.333]

Выбор типа вектора—плазмидного или фагово-го-зависит от цели эксперимента, размера внедряемого фрагмента и относительного содержания нужного фрагмента в применяемой смеси фрагментов ДНК. В целом фаговьае векторы боже эффективны, чем плазмидные, при клонировании крупных вставок, и С1фининг больщого числа негативных колоний на содержание специфической вставки провести проще, чем скрининг больщого количества бактериальных колоний (гл. 6). Самьши распространенными векторами для Е. соИ являются два бактериофага— Хи М13. [c.238]

В последние годы разработана техника сайт-специфического мутагенеза, позволяющего вводить мутации в точно определенный участок гена. Другое название этого метода — олигонуклео-тиднаправленный мутагенез. Суть метода сводиться к следующему. Фрагмент ДНК, в котором желают получить мутацию, переводится в однонитевую форму, например, на векторе фага М13. Синтезируется олигонуклеотид размером 14—21 п.о. комплементарный области, в которую должна быть введена мутация. В центре олигонуклеотида располагают нуклеотид, не комплементарный исходной последовательности ДНК. Производят отжиг олигонуклеотида с кольцевой однонитевой ДНК. Затем с помощью ДНК-полимеразы и лигазы достраивают вторую цепь и замыкают кольцо (рис. 30, I). Чтобы облегчить получение кольцевых двуспиральных замкнутых форм ДНК, часто используют второй олигонуклеотид, что сокращает путь ДНК-полиме-разе. Кольцевые замкнутые формы ДНК затем очищаются и ими трансформируются бактериальные клетки. После трансформации такой кольцевой ДНК и раунда репликации в потомстве должны находиться формы, несущие родительскую и мутантную ДНК, в соотношении 1 1. Далее, отдельные колонии бактерий или негативные колонии фага используют для скрининга мутантных форм. [c.162]

Этот вариант скрининга обусловлен низким выходом интересующего рекомбинантного клона. Высев колоний в этом случае можно производить до нескольких десятков тысяч на 90-мИ чашку (лучше не более 30 ООО). Вместо нитроцеллюлозы для переноса бактериальных клонов лучше использовать бумагу Whatman 542 (или 540, 541), так как в этом случае не требуется исключительных навыков по одергиванию колоний с агара и, в отличие от НЦФ, не возникает проблем с неполным или неравномерным отпечатыванием колоний на фильтре. Гибридизацию зовда с ДНК, иммобилизованной на бумажных фильтрах щюводят гак же, как и в случае с НЦФ (см. далее). [c.32]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология