Рекомбинантные клоны, отбор

Для определения положения сегментов в небольщих рекомбинантных геномах используются те же подходы, что и при нахождении специфических сегментов в больщих геномах до клонирования (разд. 6.Тб). После построения рестрикционной карты вставки установить точную локализацию нужного сегмента не составляет труда. Для этого нужен только подходящий меченый зонд, аналогичный ДНК- или РНК-зонду, используемому для отбора клона в начале клонирования. [c.318]

Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов - РНК, белков или ферментативной активности, т.е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например, цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует самую высокую эффективность, так как позволяет в одно касание освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов. [c.162]

Клонирование генов, расположенных в плазмидах по очевидным причинам не представляет сколь-нибудь значительных методических трудностей. В свете сказанного понятен тот факт, что на первых порах клонированию подвергались в основном гены с плазмидной локализацией. Сложнее обстоит дело в случае хромосомных генов. Для конструирования банка рекомбинантных плазмид применяется типичный арсенал известных методов генной инженерии, который в случае клонирования генов гт не имеет какой-то специфики. Специфика заключается в методах отбора искомых клонов, выборе реципиентных щтаммов и векторов для клонирования. [c.185]

В рассмотренных выше случаях клонотеки последовательностей представляли собой суспензии рекомбинантных бактериальных клеток или фаговых частиц, в которых отдельные клоны, представленные многими тысячами индивидуальных частиц, никак не были упорядочены в пространстве друг относительно друга. Такие клонотеки отвечают многим генно-инженерным задачам, например, могут быть эффективно использованы для отбора клонов методом гибридизации колоний (см. ниже). Однако в ряде случаев, например, когда процесс отбора занимает длительное время и требует анализа каждого индивидуального клона, невозможно одновременно исследовать все клоны клонотеки. По- [c.160]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

Несмотря на простоту идей, лежащих в основе получения рекомбинантных антител с использованием фагового дисплея, его реализация на практике (как впрочем и любой другой искусственной генетической системы) требует учета массы весьма существенных деталей. В частности, антигены, применяемые в такой системе, должны быть высокоочищенными полученные с помощью фагового дисплея антитела часто не взаимодействуют с нативными белками эффекты авидности могут затруднять отбор высокоаффинных клонов разные клоны с одинаковой аффинностью трудно дифференцировать друг от друга и т.д. [270-272]. [c.426]

Отбор. Следующий этап состоит в том, чтобы определить, какие клетки несут рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую нужный ген. Такие клоны можно отобрать по признаку присутствия вектора или самого встроенного гена. Например, некоторые плазмидные векторы сообщают клетке устойчивость к какому-либо антибиотику. Другой подход состоит в том, чтобы определить, какие клетки связывают РНК, комплементарную нужному гену, ил и синтезируют кодируемый им белок. Клоны, содержащие рекомбинантную ДНК, стабильны, по крайней мере в течение нескольких сотен поколений. [c.208]

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 10 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки Е. соИ, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейщее клонирование, нужно провести отбор трансформированных бактерий. [c.223]

Описанная методика отбора и выращивания Т-клеток согласуется с современными представлениями о физиологии Т-кле-ток. Контакт со специфическими аллоантигенами клеток-стимуляторов индуцирует Т-хелперные клетки как к интенсивной экспрессии рецепторов для ИЛ-2, так и к выработке этого лимфокина, что приводит к нескольким циклам аутостимуляции (Меиег et al., 1984). Некоторое время пролиферацию можно поддерживать добавлением экзогенного ИЛ-2, однако спонтанная обратная регуляция рецепторов ИЛ-2 приводит к постепенному уменьшению скорости роста, которую можно восстановить только повторной стимуляцией антигеном. Таким образом, повторная стимуляция служит двум целям — восстановлению чувствительности к ИЛ-2 и отбору антиген-специфи-ческих Т-клеток. Следует отметить, что мы никогда не наблюдали образования независимых от повторной стимуляции Т-клонов, приобретающих способность неограниченно расти в присутствии ИЛ-2. О возникновении таких клонов неоднократно сообщали авторы, работающие с Т-клетками мыши. Главное усовершенствование в культивировании Т-клеток человека состоит в возможности использования рекомбинантного ИЛ-2. При этом облегчается контроль условий культивирования и при достаточно высоких концентрациях ИЛ-2 отпадает необходимость в частых повторных стимуляциях. [c.277]

Использование антител для отбора клонов в экспрессирующих клонотеках. Получение клонотеки генов или кДНК с использованием экспрессирующих векторов дает ряд преимуществ в их последующем отборе. В этом случае, если 5-концевая часть клонируемого гена находится близко от промотора вектора или его кодирующая часть соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном через последовательность, кодирующую часть другого белка, например, 3-галактозидазы, то в бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если же рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают иммунохимическими методами. Отбор нужных клонов может проводиться и с помощью чисто генетических методов с использованием специально сконструированных векторных плазмид. [c.166]

Несмотря на то что штамм Е. соИ К12—это уникальный, отличный от других штамм Е. соИ, он не однороден по своим свойствам и на самом деле представляет собой семейство родственных бактериальных штаммов, происходящих от одного исходного изолята. Известные в настоящее время члены этого семейства отличаются друг от друга мутациями в одном или нескольких генах. Некоторые штаммы Е. соИ К12 получены с помощью направленного отбора специфических по фенотипу клонов, но большинство из них имеют неиден-тифицированные аллельные особенности. Многие из этих особенностей несущественны для свойств суб-клона, используемого в качестве хозяина для рекомбинантных молекул ДНК, однако некоторые имеют важное значение. Эти последние свойства клеток-хозяев, которые проявляются в зависимости от используемого вектора, можно разбить на несколько классов одни из них имеют отношение к точной репликации вектора, другие—к успешному [c.228]

Смотреть страницы где упоминается термин Рекомбинантные клоны, отбор: [c.120] [c.62] [c.434] [c.75] [c.209] [c.212] [c.75] [c.277] [c.518] [c.338] [c.136] [c.175] [c.218] [c.221] [c.266] [c.271] [c.277] [c.186] [c.338] [c.233] [c.236] [c.299] [c.354]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология