Нуклеиновые кислоты гибридизация, использование

Гибридизация нуклеиновых кислот, диагностические процедуры, способы детекции при использовании ПЦР, мутационный анализ [c.535]

В этой главе рассматриваются методы синтеза и использования в экспериментальных целях РНК, полученной in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ. Основное внимание мы уделили использованию радиоактивных РНК-зондов для рутинного анализа нуклеиновых кислот и не пытались изложить, кроме как в самых общих чертах, более специальные аспекты их применения, например для гибридизации in situ, в качестве смысловой мРНК или трансляционных матриц. По таким вопросам мы постарались дать ссылки на ключевые работы, которые позволят хорошо разобраться в технических возможностях этих методов. [c.12]

В этом разделе рассматриваются основные методы использования РНК-зондов при исследовании нуклеиновых кислот в обычной лабораторной практике. В раздел включены детальные описания методов, в которых РНК используются вместо ДНК-зондов при Саузерн- и нозерн- гибридизации и в опытах по защите от действия РНКазы. [c.27]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

В той или иной форме мембранная фильтрация применяется уже почти 100 лет, однако лишь с конца 40-х гг. мембранные фильтры начинают выпускать в промышленных масштабах. Использовавшиеся вначале для бактериологических исследований воды мембраны постепенно начинают применять во многих других областях науки и техники. В 50-е гг. большим шагом вперед явилось использование мембран в биохимии, благодаря чему стало возможным широкое распространение радиоизотопной техники. В 60-е гг. появилось сообщение о первом применении мембран для гибридизации нуклеиновых кислот, а в конце 70-х гг. был разработан метод рекомбинации ДНК, что повлекло за собой широкое использование мембран в генном клонировании. [c.13]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

В этой главе было описано использование мембранных фильтров в ряде отраслей биомедицины. Мы показали, что мембранные фильтры находят широкое применение в биомедицинских исследованиях как в своей обычной роли в качестве фильтрующих, так и в менее привычных ролях, а именно в качестве подложек при изучении белков и нуклеиновых кислот. Возможно, одна из наиболее широких областей применения мембранных фильтров связана с количественным определением радиоактивных веществ с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, хотя в некоторых случаях, оказывается, лучше использовать стекловолоконные фильтры. Важным достижением в области молекулярной биологии стало применение мембран из нитроцеллюлозы для гибридизации нуклеиновых кислот. Без разработки методов гибридизации с помощью мембранных фильтров было бы значительно задержано развитие технологии рекомбинантных ДНК. [c.331]

Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать их организацию (блоттинг-гибридизация по Саузерну), строение мРНК (нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например, в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-гибридизации выделенной РНК (разд., 6.3). Более подробные качественные исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]). 5 - и З -концы транскриптов определяют, используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют установить только строение транскрибируемой области или гена, а также механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции. При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями, уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей, расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором расстоянии от 5 - и З -концов транскрибируемого-гена. Используя разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК, удается, модифгщировать клонированные гены и затем после введения мутантного гена-путем генетической трансформации обратно в растения анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные методики способствовали изучению нуклеотидных [c.307]

Ни для одной вирусной РНК по1 а ие удалось определить полную нуклеотидную последовательность. Одпако степень гомологии между вирусами можно было бы определять при помощи гибридизации с использованием двухцепочечных форм РНК вирусов растений этот метод вполне может оказаться пригодным как для распределения родственных вирусов по группам, так ж для оценки степепи родства в каждой группе. Другой способ установления степени родства состоит в определении частоты 16 возможных динуклеотидов в различных нуклеиновых кислотах. Этот прием до сих пор использовался только в работе с ДНК-содержащими вирусами [1694]. [c.481]

С практической точки зрения важна реакция иодирования нуклеиновых кислот в водных растворах. При действии 1 или 1 -ионов в присутствии треххлористого таллия СТ1С1 ) на одиоцепочечные ДНК преимущественно иодируется цитозин, образуя 5-иодопроиз-водные. При реакции с РНК наряду с 5-иодцитозином образуется 5 иодо-6-гидрокси-5,6-дигидроурацил. При использовании радиоактивного 4 удается получить меченые полинуклеотиды с высокой удельной активностью, которые применяются в опытах по гибридизации. [c.387]

Можно назвать множество примеров использования микрофильтрационных мембран в качестве фильтров для сбора частиц, подвергаемых затем анализу сбор бактерий для прямого подсчета с помощью микроскопа в прошедшем свете подсчет частиц в напитках подсчет фитопланктона измерение и подсчет инертных частиц подсчет асбестовых волокон, раковых клеток, адсорбция и элюирование вирусов и подсчет жизнеспособных водопереносимых бактерий [7]. Электрофорез является электрически управляемым процессом, в котором белковые фракции разделяются либо в микропористых ацетатцеллюлозных гелях [8], либо в ультрапористых агаровых или полиамидных гелях. Активному возбуждению гибридизации нуклеиновой кислоты помогает способность нитрата целлюлозы сильно сорбировать ДНК, поэтому и ДНК ДНК-, и ДНК РНК-гибриди-зации могут быть осуществлены на мембранном фильтре [7]. [c.85]

Рис. 4-71. Использование гибридизации нуклеиновых кислот для определения участка клонированного фрагмента ДНК, который транскрибируется в мРНК. Данный метод предполагает обработку нуклеазой, расщепляющей цепи ДНК, не спаренные с комплементарной цепью РНК Этот метод позволяет точно выявлять начало и конец молекулы РНК. Аналогичные процедуры эффективны и для определения расположения нитронов

Результаты молекулярной гибридизации in situ могут быть достоверными только при условии высокой чистоты зондов поскольку метод основан на использовании избытка зонда, даже малейшие примеси могут принимать участие в гибридизации. Используя стандартные физические методы, можно получить зонды высокой чистоты для нуклеиновых кислот, имеющихся в избытке, таких как рибосомальная РНК. Однако относительно низкая концентрация большинства видов мРНК создает значительные трудности при использовании этих методов для получения зондов в чистом виде и в достаточном количестве. Проблема примесных последовательностей нуклеиновых кислот решается благодаря применению методов клонирования рекомбинантных ДНК в принципе эти методы могут быть использованы для получения зондов на любые интересующие вас гены или участки генома. [c.305]

В прошлом генетика человека и медицинская генетика развивались как относительно независимые отрасли науки, теперь многие их разделы оказались вовлеченными в общее русло молекулярно-генетичес-ких исследований, и провести между ними грань-трудно. В рамках учебника невозможно описать в деталях все молекулярно-биологические методы, которые привели к столь внушительному прогрессу генетики человека, поэтому следует обратиться к более специальным источникам [366 493 60]. Однако принципы новых подходов должны быть понятны всем исследователям, даже тем, кто изучает эволюцию или генетику поведения. В следующем разделе в качестве примера описывается анализ (3-глобинового генного кластера человека (разд. 4.3). Кроме методов, основанных на использовании рестрикционных ферментов, обсуждаются также методы гибридизации нуклеиновых кислот, сек-венирования ДНК и сортировки хромосом при помощи цитофлуорометрии. [c.122]

Существенный фактор при выполнении ДНК из растительных клеток — эффективное разрушение клеточных стенок. К сожалению, многие методы, используемые для этого, приводят к фрагментации ДНК. и, следовательно, в каждой конкретной ситуации достигается определенный компромисс между размером ДНК и ее выходом. Эту трудность можно частично преодолеть при использовании лиофилизированного материала (разд. 4.2). Однако высвобождение высокомолекулярной ДНК — это только часть задачи, поскольку экстракты растительных клеток содержат большие количества полисахаридов, таннинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Хуже того, некоторые полисахаридоподобные примеси невозможно определить обычными аналитическими методами, не приводящими к разрушению ДНК- Такие примеси препятствуют правильному определению количества нуклеиновых кислот спектрофотометрическими методами и дают аномальную кинетику гибридизации. Кроме того, что гораздо важнее, они могут подавлять активность большинства ферментов, модифицирующих ДНК, в том числе и ферментов рестрикции. Это может затруднять как анализ ДНК методом блоттинг-гибридизации по Саузерну, так и ее клонирование. [c.237]

Гибридизацию по Саузерну [7] используют для выявления и изучения организации последовательностей ДНК после их разделения с помощью гель-электрофореза. Процедура гибридизации подразделяется на два этапа. Первый этап — перенос разделенных фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану, осуществляемый под действием капиллярных сил (в последнее время применяется электроперенос) таким образом, чтобы относительное положение каждой молекулы ДНК осталось неизменным. Второй этап — гибридизация связанной ДНК с пробами, меченными изотопами (комплементарной ДНК), для выявления определенных последовательностей ДНК. Анализ ДНК по Саузерну включает в себя апуриниза-дию, денатурацию и нейтрализацию ДНК внутри геля с последующим переносом и связыванием нуклеиновой кислоты с мембраной. Далее мембрану инкубируют с одноцепочечной пробой, меченной радиоактивным изотопом, а после отмывания — выявляют гибридизовавшиеся гомологичные фрагменты ДНК путем авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. [c.277]

Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распространение этого метода на любые белки связано с использованием так называемой диазобумаги , на которой предварительно закреплены афинные сорбенты, например антитела или антигены [Erli h et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла. себе применение главным образом для гибридизации нуклеиновых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для описания ее особенностей. Отметим только способ переноса белков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в системе Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М. Na-фосфатным буфером (pH 7,4) с 0,15 М Na l и 0,5% Тритона Х-100 при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером, накрывают диазобумагой, а ее — несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклян- [c.108]

П1бр щизация. Для изучения видовой специфичности нуклеиновых кислот применяют метод гибридизации. Он основан на способности ДНК к денатурации при нагревании (80—90 °С) и ренативации при последующем охлаждении. Возможно использование метода для проведения гибридизации ДНК-ДНК и ДНК-РНК. [c.62]

Отсюда можно извлечь один урок. Нитроцеллюлозные мембраны, использованные для изучения гибридизации нуклеиновых кислот, были изобретены вовсе не для этой цели. Они долгие годы применялись для других целей и, к счастью, оказались доступными в тот момент, когда исследователи искали новые подходы к этой проблеме. Никакого систематического изучения мембран для гибридизации нуклеиновых кислот проведено не было. Возможно, существуют мембраны, которые лучше подходят для этой цели. К сожалению, выпуск мембранных фильтров — процесс настолько сложный, что исследователи, стремящиеся улучшить соответствующие методы, находятся в полной зависимости от производителей мембран. Вряд ли такое положение можно назвать удовлеворительным. Идеальный путь разработки новых методов состоит в том, чтобы исключить частнособственнические соображения. Торговые интересы должны вступать в силу лишь после того, как метод [c.331]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология