Инъекционная камера

Для микроинъекции эмбрионов необходим стабильный рабочий стол, на который устанавливают инвертированный микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. Для инъекции эмбрионы по мере надобности посредством пониженного давления фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором ДНК. Для инъекции пипетку через прозрачную оболочку и клеточную мембрану вводят в пронуклеус, после чего в него инъецируют 1—2 пкл раствора ДНК. О точности операции судят по набуханию пронуклеуса. Только такое визуальное увеличение объема ядра свидетельствует о том, что раствор ДНК был действительно введен в пронуклеус. После инъекции эмбрионы освобождаются от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам. [c.227]

При помощи микроманипулятора установите микропипетку над инъекционной камерой так, чтобы ее кончик располагался горизонтально. При использовании объектива 4Х в поле зрения микроскопа должна появиться тень микропипетки. Опустите пипетку в инъекционную камеру. Удостоверьтесь, что в пределах поля зрения пипетка свободно перемещается в горизонтальной плоскости и не задевает дно инъекционной камеры. [c.337]

Закрепляют трубки в приборе. Заполняют анодную камеру (обычно верхнюю) 0,2%-ной серной (или фосфорной) кислотой, а катодную — 0,4%-ным этаноламином (или этилендиамином). Включают источник питания (сила тока до 2 мА на трубку). По мере падения электропроводности можно постепенно увеличивать напряжение вплоть до 400 В, поддерживая постоянную силу тока. Через 1—3 ч отключают источник питания и удаляют гель из трубок, подавая воду между стенкой трубки и гелем с помощью инъекционной иглы. [c.325]

Наилучшей оптической системой для визуализации внутренних структур одноклеточного яйца является система дифференциального контраста Номарского (DI ). Однако эта оптика стоит очень дорого, и к тому же она требует, чтобы инъекционная камера обязательно была стеклянной. Система модуляционного контраста Хоффмана не позволяет получить столь же высокое разрешение, как DI -оптика, но гораздо дешевле и совместима с пластиковыми инъекционными камерами. Если [c.334]

Стеклянные инъекционные камеры совместимы с инвертированными микроскопами любой оптической системы. Силикони-зируйте стеклянную пластину с лункой, погрузив ее в 3%-ный раствор дихлорметилсилана в хлороформе. Промойте стекло большим количеством воды и затем еще раз вымойте с каким-нибудь детергентом. Обмойте стекло этанолом и оботрите насухо хлопчатой тканью. Нанесите в центр лунки плоскую каплю среды М2 (в поперечнике ее размер не должен превышать 1 см). Сверху наслоите легкое парафиновое масло, чтобы предотвратить высыхание. Установите инъекционную камеру на столике микроскопа и, используя объектив 4Х, сфокусируйте оптику на дне капли. [c.336]

Работают с микроинъекционной пипеткой с помощью правого микроманипулятора. Инструментальную трубку Leitz соединяют отрезком шланга Tygon длиной приблизительно 1 м с 50 мм-шприцем со стеклянным поршнем (поршень можно смазать топким слоем парафинового масла). Система заполнена воздухом. В инъекционную пипетку вводят раствор ДНК с тыльной стороны, используя капиллярный эффект. Пипетка считается заполненной, когда жидкость покажется па рабочем конце. Следите за тем, чтобы в раствор ДНК не попали загрязнения, например тальк с перчаток или ферменты с незащищенных рук. Установите пипетку в инструментальную трубку и закрепите последнюю в держателе микроманипулятора. Используя микроманипулятор, установите инъекционную пипетку так, чтобы ее кончик располагался над инъекционной камерой. Затем осторожно опустите кончик пипетки в каплю среды М2, контролируя перемещение пипетки под микроскопом (используйте объектив 4Х). Удостоверьтесь, что пипетка может свободно перемещаться в вертикальной плоскости. [c.338]

Смонтируйте и подготовьте приборы для микроинъекции, как описано в разд. 10.3.L При помощи трансплантациоппой пипетки общего назначения отберите примерно 20 оплодотворенных яйцеклеток из М16-микрокапельной культуры (поддерживаемой при 37 °С). Промойте дважды яйцеклетки водой, введите их в минимальном объеме жидкости в пипетку и затем выдуйте в инъекционную камеру. Контролируйте поведение яйцеклеток в инъекционной камере визуально, используя объектив 4Х. Постарайтесь собрать яйцеклетки группой под инъекционной и поддерживающей пипетками. Следите за тем, чтобы вместе с яйцами в инъекционную камеру не попали пузырьки воздуха — это может полностью ее нарушить не только яйцеклетки потеряются, но и всю инъекционную камеру придется готовить заново. [c.338]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология