Лактатдегидрогеназа, аффинная элюция

Присутствие пирувата увеличивает стабильность комплекса фермента с иммобилизованным коферментом, повышая сродство лактатдегидрогеназы к этому сорбенту по сравнению с другими NAD-зависимыми ферментами. Подобный метод называют аффинной элюцией. [c.247]

Кроме того, при связывании с лигандом могут происходить конформационные перестройки белка. Известно, что конформа-дионные изменения действительно имеют место [59, 60], и они Могут значительно изменить взаимодействие белка с адсорбентом в любом направлении. Убедительных доказательств кон-формационных изменений, приводящих к более прочной сорбции, не было получено, хотя для некоторых ферментов, особен- Яо для енолазы из дрожжей, эффекты, связанные с аффинной элюцией, столь слабы (значительно слабее ожидаемых эффектов при изменении заряда), что такие усиливающие сорбцию конформационные изменения вполне могут существовать. Конформационные изменения, вызывающие ослабление адсорбции, по-видимому, действительно имеют место, особенно в случае фосфоглицераткиназы, аденилаткиназы и лактатдегидрогеназы 38, 48]. [c.138]

Хроматография на КМ-целлюлозе. Аффинная элюция. Измеряют pH раствора и доводят его соляной кислотой до 7,2. Раствор белка наносят на колонку с КМ-целлюлозой (13X5,5 см), уравновешенную буфером А, pH 7,2. После того как белок адсорбировался на колонке, ее промывают 75—100 мл буфера А (скорость тока 200 мл/ч). На этой стадии может потребоваться использование перистальтического насоса. Затем колонку промывают буфером Б, pH 8,0. При этом элюируются различные примесные белки, а лактатдегидрогеназа остается связанной с носителем. После того как через колонку пройдет 5—6 объемов буфера Б, оптическая плотность элюата при 280 нм начинает уменьшаться. Необходимо продолжать промывание буфером Б до тех пор, пока снижение Л280 не прекратится ( 280 может достигнуть значения 0,1—0,2 или меньше). Затем на колонку подают буфер В. После прохождения через колонку 1—2 объемов этого буфера определяют активность лактатдегидрогеназы в собираемых фракциях. В случае ее отсутствия на колонку подают буфер Г. Определяют активность лактатдегидрогеназы во фракциях элюата. Если ее нет либо она незначительна, на колонку подают буфер Д. Собирают фракции, определяют в них активность фермента и содержание белка (по поглощению при 280 нм за вычетом фона, который дает НАДН). Фракции, содержащие наибольшую активность, объединяют и добавляют к ним ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и мелкоизмельченный сульфат аммония для кристаллизации. [c.276]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология