Аффинная элюция

АФФИННАЯ ЭЛЮЦИЯ С ИОНООБМЕННИКА [c.451]

Для иллюстрации изложенных в предыдущем разделе обш их соображений и возможностей использования различных аффинных сорбентов рассмотрим определенное число примеров, отобранных из периодической научной литературы последних трех лет. Большая их часть относится к очистке ферментов клеточного метаболизма (и отдельно — белков, регулирующ,их активность нуклеиновых кислот). Далее будут приведены примеры аффинного фракционирования и очистки самих нуклеиновых кислот, в том числе на иммуносорбентах. Основное внимание уделим более простому и универсальному методу — неспецифической элюции, однако био-снецифическая аффинная элюция белков тоже будет представлена несколькими типичными примерами. Рассмотрение начнем с использования сорбентов с индивидуальной специфичностью, ограничившись здесь тремя примерами, поскольку нет смысла пытаться сколько-нибудь полно иллюстрировать бесчисленное разнообразие возможных сорбентов этого типа. Аффинная хроматография белков клеточного метаболизма на сорбентах с групповой специфичностью будет иллюстрирована подробнее, а затем последуют два примера использования ковалентной хроматографии. [c.412]

Хотя синтез аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью при наличии одной из продажных активированных матриц и не представляет особого труда, он все же требует наличия достаточного количества очищенного аффинного лиганда, не инактивирующегося в условиях его посадки на матрицу. Заметим, что после посадки лиганда на матрицу прочность связывания с ним биоспецифического партнера может сильно уменьшиться по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при образовании их свободного комплекса в растворе (иной раз константа диссоциации комплекса на сорбенте может оказаться на три порядка выше, чем в растворе). Это обстоятельство играет важную роль при осуществлении конкурентной аффинной элюции вещества с сорбента с использованием свободного лиганда (см. ниже). Тем не менее прочность аффинного связывания в большинстве случаев оказывается достаточной для удержания нужного вещества на матрице в условиях отмывки с нее всех сопутствующих ему примесей. Нередко прочность комплекса вещества с аффинным лигандом увеличивается, если последний имеет некоторую свободу ориентирования в пространстве, т. е. закреплен на матрице с помощью спейсера. [c.362]

Присутствие пирувата увеличивает стабильность комплекса фермента с иммобилизованным коферментом, повышая сродство лактатдегидрогеназы к этому сорбенту по сравнению с другими NAD-зависимыми ферментами. Подобный метод называют аффинной элюцией. [c.247]

АФФИННАЯ ЭЛЮЦИЯ С ИОНООБМЕННИКОВ И ДРУГИХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ АДСОРБЕНТОВ [c.133]

Большинство исследователей под аффинной хроматографией понимают использование иммобилизованного на адсорбенте лиганда, осуществляющего специфический отбор связывающихся с этим лигандом белков (разд. 4.5). После адсорбции фермент может быть элюирован либо неспецифическим образом, например, путем повышения концентрации соли, либо специфическим в результате замещения белка свободным лигандом в растворе. Следовательно, аффинная хроматография может включать две специфические стадии — аффинную адсорбцию и аффинную элюцию . Механизм элюции со специфического адсорбента достаточно ясен. С практической точки зрения присутствие лиганда снижает коэффициент распределения с 1,0 до значитель- [c.133]

Рис. 4.22. Принципы аффинной элюции с катионообменника. А. Положительно заряженный белок адсорбируется на ионообменнике. Б. Введен отрицательно заряженный лиганд, который при связывании с белком уменьшает его общий заряд. В. Белок элюируется, так как величина а уменьшается благодаря снижению общего заряда белка.

На рис. 4.22, 4.23 и 4.24 схематически представлены основные принципы аффинной элюции с ионообменников. Фермент [c.134]

Рис. 4.24. Проведение аффинной элюции. Л. Образец наносят при том же значении pH, при котором проводят элюцию влияние лиганда настолько велико, что величина а уменьшается от >0,95 до очень низкой величины. Б. Образец наносят при рНд, когда а 1,0, затем повышают pH до В, чтобы снизить величину а примерно до 0,9. В результате добавление лиганда оказывает значительное влияние (как показано на рис. 4.23). В. То же, что и на рис. Б, но с подставным> лигандом. На практике подставной лиганд можно использовать, когда начинают промывать колонку буфером с рНв-Заштрихованные пики представляют собой элюированный фермент.

Можно предложить два других объяснения эффекта аффинной элюции. Помимо того что лиганд снижает общий заряд белка, он связывается с центром, в котором сосредоточены заряды, противоположные по знаку заряду лиганда. Такое связывание может маскировать достаточно специфичное сильное взаимодействие между этими зарядами и адсорбентом. Кроме того, поскольку активный центр фермента расположен, вероят- но, близко к поверхности белковой молекулы, заряженные остатки активного центра оказывают более сильное влияние на [c.137]

Кроме того, при связывании с лигандом могут происходить конформационные перестройки белка. Известно, что конформа-дионные изменения действительно имеют место [59, 60], и они Могут значительно изменить взаимодействие белка с адсорбентом в любом направлении. Убедительных доказательств кон-формационных изменений, приводящих к более прочной сорбции, не было получено, хотя для некоторых ферментов, особен- Яо для енолазы из дрожжей, эффекты, связанные с аффинной элюцией, столь слабы (значительно слабее ожидаемых эффектов при изменении заряда), что такие усиливающие сорбцию конформационные изменения вполне могут существовать. Конформационные изменения, вызывающие ослабление адсорбции, по-видимому, действительно имеют место, особенно в случае фосфоглицераткиназы, аденилаткиназы и лактатдегидрогеназы 38, 48]. [c.138]

В общем можно сказать, что аффинная элюция эффективна, если фермент и лиганд обладают следующими свойствами [c.138]

Из-за ограничений, указанных в пункте а, и ввиду того, что практически все лиганды (за исключением ионов металлов) отрицательно заряжены, аффинная элюция с ионообменников осуществляется только применительно к нейтральным и основным белкам, которые адсорбируются на катионообменнике при нейтральных значениях pH (6—8). Аффинная элюция (ионами Мд +) наблюдалась в процессе очистки пируваткиназы, адсор- [c.138]

Практические этапы аффинной элюции [c.139]

В этом разделе описываются этапы аффинной элюции. Образец уравновешивают в соответствующем буфере и наносят на ионообменную колонку, заполненную, например, КМ-целлюлозой. Нужный фермент полностью адсорбируется колонку с нанесенным образцом промывают небольшим количеством исходного буфера. Если эффект аффинной элюции значителен, то pH исходного буфера может быть тем же, что и pH буфера для элюции. Однако чаще pH в колонке повышают до соответствующего значения, при ротором нужный фермент только начинает двигаться, например когда а = 0,95—0,90 (рис. 4,23 и 4.24). Затем на колонку наносят раствор лиганда, концентрация которого должна превышать по величине константу диссоциации-комплекса фермент — лиганд, и если фермента много, то общее количество лиганда, выраженное в молях, должно быть больше количества (в молях) центров связывания. С другой стороны,, концентрация лиганда не должна существенно изменять ионную-силу буфера. Максимальное количество используемого лиганда часто определяется соображениями стоимости, но если константа диссоциации его комплекса с белком достаточно высока и требуемые концентрации лиганда приводят к повышению ион-ной силы буфера, то может потребоваться введение стадии вымывания подставным лигандом . В этом случае на этапе, предшествующем элюции, используют соединение, имеющее.л от же заряд, что -И лиганд, но не связывающееся с ферментом. Все-белки, которые выходят из колонки при повышении ионной си- [c.139]

Аффинная элюция с других неспецифических адсорбентов [c.144]

Фосфоцеллюлоза представляет собой один из ионообменников, применявшихся во многих опубликованных работах по проведению аффинной элюции. Однако при использовании фосфоцеллюлозы наблюдаются специфические эффекты, особенно ес- [c.144]

Такие гипотетические смешанные адсорбенты до сих пор не получены. Следовательно, пока эта идея остается лишь предположением. Так как многие лиганды заряжены отрицательно, автоматически будет проявляться катионообменный эффект, и хотя предпочтительно работать с системой при таких значениях pH и ионной силы, которые позволяют избегать подобных эффектов, однако даже в идеальном случае это трудно достижимо. Например, киназа с незначительным сродством к АМР не связывается с АМР-агарозой в 0,1 М фосфатном буфере, но может связаться со смешанным катионообменником за счет отрицательного заряда АМР в более слабом буфере, таком, как 0,01 М МЭС или МОПС. Хотя при этом могут связываться и другие основные ферментные белки, это не означает, что они будут вымываться при аффинной элюции с помощью свободного АТР, используемого для элюции киназы, если только концентрация АТР не будет значительно повышать ионную силу. [c.158]

Кристаллизация. После аффинной элюции можно провести кристаллизацию фермента. Элюат, содержащий глюкозофосфатизомеразу, диализуют в течение ночи против насыщенного сульфата аммония, приготовленного на 25 мМ триэтаноламине, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол, pH 8,2. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в том же буфере разводят до концентрации белка 10 мг/мл. К раствору белка медленно на холоду добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 48%-ного насыщения. Выпавший при этом аморфный осадок удаляют. Раствор белка оставляют а ночь при комнатной температуре для кристаллизации. [c.237]

Для того чтобы снизить а перед проведением аффинной элюции, необходимо иметь представление о характере взаимодействий между белком и адсорбентом. Повышение концентрации соли значительно снижает биоспецифическое связывание белка, [c.160]

НО может также привести к ослаблению взаимодействия белка со свободным лигандом при аффинной элюции (повышение величины Kl). Повышение концентрации соли ослабляет любые неспецифические ионные взаимодействия, но при этом усиливаются гидрофобные взаимодействия белка с адсорбентом, в особенности с удлиняющим мостиком. Если взаимодействия последнего типа важны, более эффективным может быть снижение концентрации соли. Кроме того, используют вещества, снижающие поверхностное натяжение (уменьшающие гидрофобные вандерваальсовы взаимодействия). Это может быть неионный [c.161]

Следует заметить, что прямое присоединение красителя к остову матрицы не уменьшает способность красителя связывать ферменты, т. е. в этом случае не нужен удлиняющий мостик. Как упоминалось в предыдущем разделе, причина, по которой при слабом взаимодействии фермента с лигандом необходим мостик, заключается не столько в возможности расположить лиганд на некотором расстоянии от матрицы, сколько в том, что введение мостика приводит к появлению неспецифических сил взаимодействия, усиливающих связывание. При величине /Сг(/Ср), лежащей в пределах 10 М, и высоких значениях т< для хорошей адсорбции белка на колонках с окрашенным адсорбентом не требуется дополнительных взаимодействий. Это видно из уравнения (4.5), например, при т< = 0,1 мМ, р<= =0,05 мМ и /Гр=0,001 мМ а = 0,98. Из сказанного должно следовать, что окрашенные адсорбенты идеально приспособлены для белков, связывающих нуклеотиды, особенно в сочетании с аффинной элюцией. На практике же возникает ряд трудностей. Главная из них заключается в неспецифических силах связывания, которые могут быть причиной менее эффективной аффинной элюции. Кроме того, существует такое множество белков, связывающих нуклеотиды, что если все эти белки, присутствующие в смеси, адсорбируются на колонке, то высокой степени очистки получить не удастся. [c.166]

Существует несколько блестящих примеров успешного применения окрашенных адсорбентов, но в большинстве случаев их используют как определенный этап очистки, которому предшествуют или за которым следуют другие этапы. Правильное применение принципов аффинной элюции к процессу хроматографии, несомненно, способствовало бы усовершенствованию некоторых опубликованных методик. [c.167]

Для аффинной элюции следует использовать истинные субстраты хотя теоретически в этом качестве может выступать и свободный краситель, он оказывается менее специфичным. Так, для киназ используется АТР( Мд), для дегидрогеназ — NAD+ (или предпочтительнее ЫАОН, который более прочно связывается с большинством дегидрогеназ), для АМР-связы-вающих ферментов (например, для фруктозо-1,6-бисфосфата- [c.170]

Иногда явление биологического сродства используется только в процессе олюцни. В этом случае вещество связывается с поверхностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия пли сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфигурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру. [c.11]

Речь пойдет об аффинной элюгщн вещества с ионооблгеннпка. Термин аффинная элюция мы на.меренно сохранили именно для этого случая во избежание терминологической путаницы, хотя его нередко. можно встретить в литературе при описании процессом биоспецифической конкурентной элюгщи вещества с истинно аффинных сорбентов. [c.451]

Прп очевидном выигрыше в избирательности очпсткп всем методам аффинной элюции присущ один недостаток — они относительно дороги ввиду необходимости использовать в элюенте чистые препараты субстратов или кофакторов, хотя и в небольшой (как видно из при.меров) концентрации. [c.452]

Хроматография на КМ-целлюлозе. Аффинная элюция. Измеряют pH раствора и доводят его соляной кислотой до 7,2. Раствор белка наносят на колонку с КМ-целлюлозой (13X5,5 см), уравновешенную буфером А, pH 7,2. После того как белок адсорбировался на колонке, ее промывают 75—100 мл буфера А (скорость тока 200 мл/ч). На этой стадии может потребоваться использование перистальтического насоса. Затем колонку промывают буфером Б, pH 8,0. При этом элюируются различные примесные белки, а лактатдегидрогеназа остается связанной с носителем. После того как через колонку пройдет 5—6 объемов буфера Б, оптическая плотность элюата при 280 нм начинает уменьшаться. Необходимо продолжать промывание буфером Б до тех пор, пока снижение Л280 не прекратится ( 280 может достигнуть значения 0,1—0,2 или меньше). Затем на колонку подают буфер В. После прохождения через колонку 1—2 объемов этого буфера определяют активность лактатдегидрогеназы в собираемых фракциях. В случае ее отсутствия на колонку подают буфер Г. Определяют активность лактатдегидрогеназы во фракциях элюата. Если ее нет либо она незначительна, на колонку подают буфер Д. Собирают фракции, определяют в них активность фермента и содержание белка (по поглощению при 280 нм за вычетом фона, который дает НАДН). Фракции, содержащие наибольшую активность, объединяют и добавляют к ним ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и мелкоизмельченный сульфат аммония для кристаллизации. [c.276]

Теоретически существуют два общих метода элюции белков-(не считая аффинной элюции, разд. 4.4) а) изменение pH буфера до величины, при которой связывание белка с адсорбентом ослабевает для анионообменников используют более низкие значения pH, а для катионообменников — более высокие б) повышение ионной силы, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом. На практике метод а не всегда дает хорошие результаты. Это объясняется тем, что цри недостаточно высокой буферной емкости резкое и значительное изменение pH по мере элюции белков приводит к плохому разделению индивидуальных компонентов. При-низкой ионной силе буферная емкость должна быть низкой, и попытка изменить значение pH, используя градиент pH, оказывается тщетной из-за буферной силы белков, адсорбированных на колонке, а в случае использования ДЭАЭ-адсорбентов— из-за буферных свойств самого адсорбента. Типичный результат показан на рис. 4.12. Градиент pH может быть успешно использован только тогда, когда интересующие нас белки первыми и очень прочно адсорбируются на ионообменнике. В этом случае можно использовать сильное забуферивание растворов при ионной силе 0,1 и больше. В одной из работ [29] была предложена схема получения сильных буферных градиентов pH при постоянной ионной силе. [c.113]

Минимальная величина колонки, несомненно, определяется концентрацией белка и соотношением объемов колонки и образца. Но более важными параметрами являются фактическая еМ кость колонки для адсорбируемых белков и длина пути, необходимая для их хроматографического разделения (о последнем-параметре иногда говорят, что он эквивалентен определенному числу теоретических тарелок ). В некоторых случаях, особенно при ступенчатой и аффинной элюции, можно использовать-короткую колонку, в которой половину объема занимает первоначальная зона адсорбированного образца. Так как при ступенчатой элюции не требуется полного хроматографического разделения, для снижения диффузии лучше уменьшить неиспользуемый объем колонки. Однако при ступенчатой элюции редко встречаются ситуации типа все или ничего (а = 1,0 или а=0), поэтому на профиль элюции будет оказывать влияние частичное уде рживание белков в неиспользуемой нижней части колонки. Для более тонкой элюции с использованием градиентов нужна колонка, длина которой в 5—20 раз превышала бы длину колонки, необходимой для адсорбции. [c.125]

Если очистку фермента проводят на анионообменнике, то образец наносят при более высоких значениях pH, а элюцию осуществляют путем снижения pH. Однако следует помнить, что при использовании анионообменников лиганд должен быть положительно заряжен. Если добавлен отрицательно заряженный лиганд, эффект будет сложным. Наиболее вероятно, что сам лиганд йеспецифически заместит белки в процессе обычно-хо ионного "обмена при этом он свяжется с ионообменннком более прочно, чем белки. Кроме того, лиганд специфически свяжется со своим ферментом, но это должно привести (по крайней мере теоретически) к более прочной адсорбции фермента, так как он приобретет при этом еще больше отрицательных за-фядов. Была сделана попытка использовать отрицательную аффинную элюцию , при которой связанный на колонке фер- [c.140]

Порат [68, 69] ввел в употребление диполярные ионообмен- ники (см. также разд. 4.8), обладающие высргкими адсорбционными емкостями, но по своему поведению несколько отличающиеся от ионообменников. Они содержат как положительно, так и отрицательно заряженные группы. Изучение этих адсорбентов с целью их использования для аффинной элюции, по-видимому, 1будет оправдано. [c.146]

В заключение следует отметить, что при аффинной адсорбционной хроматографии энергия взаимодействия между белком и носителем должна составлять по крайней мере 35 кДж-моль , что редко наблюдается при единичном взаимодействии белок — лиганд. Половина (и даже более) этой величины иногда приходится на неспецифические взаимодействия, обусловленные гидрофобными силами между аминокислотными остатками на поверхности белковой молекулы и удлиняющим мостиком. В этом случае аффинная элюция должна давать хорошие результаты и вполне достаточно весьма слабых специфических взаимодействий. Низкий процент связывания белка аффинным адсорбентом в некоторых случаях можно объяснить необходимостью биоспецифичного взаимодействия в двух точках (рис. 4.40), но более вероятно, что это обусловлено необходимостью еще и неспецифического связывания (помимо био-специфического). Если на взаимодействия обоих указанных типов налагаются строгие пространственные ограничения, то лишь относительно небольшое число молекул лиганда будет ориентировано надлежащим образом и сможет связаться белком (рис. 4.41). [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология