Методы введения случайных мутаций

Методы введения случайных мутаций [c.323]

В настоящее время неизвестны частоты встречаемости белков с заданной вторичной, а тем более третичной структурами, среди набора полипептидов со случайными последовательностями аминокислотных остатков. Поэтому для поиска белковых молекул, обладающих требуемыми свойствами, необходимо использовать клонотеки очень большого размера, в идеале содержащие максимально возможное количество компонентов, с которым еще можно работать экспериментальными методами. Разнообразие в клонотеках нуклеотидных последовательностей, кодирующих исследуемые белки, создается введением в гены случайных мутаций. [c.322]

Умение индуцировать мутации в клонированных генах с целью получения мутантных белков лежит в основе белковой инженерии. При этом используют две группы методов, приводящих к разным последствиям на молекулярном уровне. Первая группа основана на случайном мутагенезе, т.е. введении в мутагенизиру-емый участок гена многих мутаций, положение каждой из которых не контролируется исследователем, а ограничивается лишь размером фрагмента нуклеиновой кислоты, в который эти мутации вводятся. Более или менее случайный мутагенез имеет место, в частности, при инкубации нуклеиновых кислот с химическими мутагенами или осуществлении их синтеза с помощью ДНК-полимераз с ослабленной специфичностью в отношении субстра-тов-предшественников. Совокупность этих подходов активно используется при проведении направленной эволюции белковых молекул. Вторая группа методов, получившая название направленного или сайт-специфического мутагенеза, обеспечивает введение мутаций в строго определенные участки нуклеиновых кислот, что позволяет заменять отдельные аминокислотные остатки в кодируемых этими молекулами белках и ферментах. Направленный мутагенез является сердцем (но не мозгом) рационального дизайна и редизайна белковых молекул, к рассмотрению которого мы сейчас переходим. [c.278]

Практически все описанные выше методы основаны на способности эукариотических клеток интегрировать инъецированную ДНК в случайные сайты генома. Однако нередко оказывается более удобным. а иногда и необходимым введение новой генетической информации в определенные хромосомные сайты. До недавнего времени это удавалось осуществить лишь у дрожжей (разд. 5.6.в). Теперь благодаря конструированию специфических векторов. которые рекомбинируют с гомологичными последовательностями хромосом млекопитающих, здесь был достигнут значительный прогресс. Используя эти методы в сочетании с технологиями, позволяющими изолировать нужные клетки и вводить их в ранние мышиные эмбрионы, можно получать животных, несущих специфические мутации в определенных генах, или элиминировать мутации из дефектных генов. [c.368]

Опухоли часто возникают не от вирусной инфекции, а в результате мутаций, происходящих случайно или же под действием химических канцерогенов или облучения. Из таких опухолевых клеток можно получить очищенную ДНК и проверить ее на наличие онкогенов путем введения в нетрансформированные клетки в культуре in vitro. Для такого теста часто используют клетки ЗТЗ, поскольку они неопределенно долго делятся в культуре и содержат мутации, благодаря которым их легко трансформировать добавлением всего лишь одного онкогена. Онкоген, ответственный за такую трансформацию, может быть выделен, клонирован и секвенирован с помощью метода рекомбинантной ДНК (рис. 13-33). Нримечательно, что в большинстве случаев, когда это было сделано, онкоген оказывался мутантной формой одного из тех самых протоонкогенов, которые были выделены с использованием ретровируса, хотя при этом было открыто и несколько новых онкогенов. [c.428]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология