Мутагенез сайт-специфический

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. [c.85]

В последнее время в молекулярной генетике все большее применение начинают получать методы сайт-специфического или направленного мутагенеза. Уже первые опыты их применения для исследования первичных процессов фотосинтеза дали очень интересные и многообещающие результаты. Остановимся кратко на этих данных и на особенностях направленного мутагенеза фотосинтезирующих организмов. [c.337]

М13, применяемым в качестве вектора, заключается в ее небольшом размере, позволяющем встраивание больших фрагментов ДНК без нарушения стабильности. Однонитевые ДНК являются к тому же идеальной мишенью для сайт-специфического мутагенеза (см. Локализованный и сайт-специфический мутагенез ). [c.154]

Таким образом, с помощью данной конструкции можно проводить клонирование, секвенирование и экспрессию генов под контролем сильных промоторов, а также прямой отбор рекомбинантов и сайт-специфический мутагенез. [c.154]

Локализованный и сайт-специфический мутагенез [c.159]

Химическая модификация мутантных белков, полученных сайт-специфическим мутагенезом. Комбинированное использование методов направленного мутагенеза и химической модификации боковых цепей мутантных белков, полученных первым методом, дает возможность включать в полипептидные цепи неприродные аминокислотные остатки, что не может быть реализовано каждым из этих методов в отдельности. При таком подходе с помощью направленного мутагенеза в исследуемый участок полипептидной цепи вводят остаток природной аминокислоты, содержащий легко модифицируемую функциональную группу (например, остаток ys), которую далее изменяют химическими методами. [c.305]

Рассмотренные подходы к получению сайт-специфических мутаций с помощью олигонуклеотидов позволяют с высокой точностью и эффективностью производить замены отдельных нуклеотидов в строго определенных локусах. Однако чаще всего невозможно предсказать фенотипические последствия мутационных замен отдельных аминокислот в полипептидных цепях белков, и для получения необходимых фенотипических изменений требуется внесение множественных мутаций в определенные участки гена с последующим отбором мутантов требуемого фенотипа. Для решения подобных задач был разработан и эффективно используется метод кассетного мутагенеза. [c.323]

Рис. 8 6, Направленный сайт специфический мутагенез с помощью синтетического олигонуклеотида.

Сайт-специфический мутагенез [c.95]

Сайт-специфический мутагенез с использованием синтетических олигонуклеотидов гетеродуплексный метод. Синтетический олигонуклеотид служит праймером при синтезе мутантной вставки в рекомбинантном М 13-векторе. [c.348]

Одноцепочечные олигонуклеотиды используют в качестве праймеров для сайт-специфического мутагенеза in vitro. [c.86]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединение ГРЧ к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых аминокислот (Ш5-18, Н15-21 и 01ц-174) — лигандов для ионов необходимых для высокоаф- [c.208]

Есть еще одна возможность — повысить субстратную специфичность фермента. В одной из серий экспериментов с помощью сайт-специфического мутагенеза заменяли нуклеотиды, кодирующие одну или две аминокислоты ксилозо/глюкозоизомеразы термофильной бактерии lostridium thermosulfurogenes. Выбор сайтов для модификации основывался на данных об участии соответствующих аминокислот в связывании субстрата. Замена триптофана в положении 139 на фенилаланин или валина в положении 186 на треонин привела к повышению каталитической эффективности k JKy фермента в отношении глюкозы в 1,7 и 2,6 раза соответственно (табл. 13.6) и к ее уменьшению для ксилозы в 2 и 7 раз. При одновременной замене двух аминокислот каталитическая эффективность в отношении глюкозы повысилась в 5,7 раза, а в от- [c.291]

Для кардинального повышения уровня экспрессии использовались два других подхода (табл. 18.1). В первом случае методом сайт-специфического мутагенеза изменяли те участки выделенного гена токсина, которые могли бы быть ответственны за снижение эффективности транскрипции или трансляции в растении-хозя-ине (в этих экспериментах использовали и табак, и томаты). При этом нуклеотидная последовательность измененного гена на 96,5% совпадала с таковой у гена дикого типа. Трансгенные растения, в которых экспрессировался такой слабо модифицированный ген, синтезировали в 10 раз больше токсина, чем растения, трансформированные геном дикого типа. [c.391]

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подх.одящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [c.183]

Обратимся теперь к методу Фершта, точнее подходу, включающему целый комплекс методов. Своим появлением он обязан становлению в начале 1980-х годов генетической инженерии, сделавшей доступными любые полипептидные последовательности стандартных аминокислот. В результате открылась уникальная возможность получения сколь угодно представительного набора искусственных белковых аналогов, отличающихся от природного объекта числом и местом аминокислотных замен [125, 126]. На основе сайт-направ-ленного мутагенеза был разработан метод экспериментальной оценки энергии невалентных взаимодействий, впервые опробованный при изучении функционирования тирозил-тРНК-синтетазы [127—129]. Выявив в этих работах возможность получать количественные данные о структуре и энергетике боковых цепей при изменении аминокислотной последовательности, Фершт и соавт. [130-132] предприняли попытку использовать метод в исследовании обратимой денатурации белков, причем сразу в двух аспектах. Во-первых, в создании принципиально нового метода изучения механизма свертывания белковой цепи на уровне отдельных аминокислотных остатков. Сайт-специфические мутантные белки служат здесь инструментами — зондами, позволяющими получать тонкую структурную информацию о процессе самоорганизации белка, недоступную другими экспериментальными методами. Во-вторых, в разработке новой стратегии исследования ренатурации белков с помощью обычно используемых методов ЯМР- и КД-спектроскопии, остановленной струи, изотопного обмена и т.д. Существенное изменение ситуации обусловлено появлением у каждого метода вместо одного объекта исследования многочисленной группы его целенаправленно модифицированных аналогов. Расширение материальной базы открыло перспективу для повышения интерпретационных возможностей экспериментальных методов, особенно при их комплексном использовании. Реализация возросших возможностей потребовала совершенствования методологических подходов. [c.386]

Белковая инженерия. В начале 80-х годов в генетической инженерии был разработан метод, позволяющий получать измененные белки, отличающиеся от белков-прототипов заменой всего лищь одного аминокислотного остатка в строго заданном положении. Для биотехнологии этот метод, названный сайт-специфическим мутагенезом, или белковой инженерие интересен тем, что позволяет целен равЛеннб изменять структуру ферментов, а значит, их каталитические свойства и стабильность. [c.133]

Реально ли конструирование ферментов Вероятно, ответ на этот вопрос можно будет получить с развитием генетической инженерии. Первые успехи в сайт-специфическом мутагенезе ферментов уже имеются показана возможность биосинтеза Т4 лизоцима, содержащего дополнительную дисульфидную связь для увеличения стабильности (L. D. Реггу, R. Wetrel, 1984). Для тирозил-тРНК-синтетазы заменой аминокислоты в структуре активного центра удается понизить значение Км ферментативной реакции (А. R. Fersht et а I, 1984). [c.67]

В последние годы разработана техника сайт-специфического мутагенеза, позволяющего вводить мутации в точно определенный участок гена. Другое название этого метода — олигонуклео-тиднаправленный мутагенез. Суть метода сводиться к следующему. Фрагмент ДНК, в котором желают получить мутацию, переводится в однонитевую форму, например, на векторе фага М13. Синтезируется олигонуклеотид размером 14—21 п.о. комплементарный области, в которую должна быть введена мутация. В центре олигонуклеотида располагают нуклеотид, не комплементарный исходной последовательности ДНК. Производят отжиг олигонуклеотида с кольцевой однонитевой ДНК. Затем с помощью ДНК-полимеразы и лигазы достраивают вторую цепь и замыкают кольцо (рис. 30, I). Чтобы облегчить получение кольцевых двуспиральных замкнутых форм ДНК, часто используют второй олигонуклеотид, что сокращает путь ДНК-полиме-разе. Кольцевые замкнутые формы ДНК затем очищаются и ими трансформируются бактериальные клетки. После трансформации такой кольцевой ДНК и раунда репликации в потомстве должны находиться формы, несущие родительскую и мутантную ДНК, в соотношении 1 1. Далее, отдельные колонии бактерий или негативные колонии фага используют для скрининга мутантных форм. [c.162]

Селекция конструкций, в которых один сайт рестрикции создан путем вставки фрагмента ДНК или сайт-специфическо-го мутагенеза. [c.83]

Селекцию мутировавших последовательностей ДНК, полученных в результате сайт-специфического мутагенеза на основе использования синтетических полинуклеотидов, описали Норрис и др. (Norris et al., 1983). [c.86]

Умение индуцировать мутации в клонированных генах с целью получения мутантных белков лежит в основе белковой инженерии. При этом используют две группы методов, приводящих к разным последствиям на молекулярном уровне. Первая группа основана на случайном мутагенезе, т.е. введении в мутагенизиру-емый участок гена многих мутаций, положение каждой из которых не контролируется исследователем, а ограничивается лишь размером фрагмента нуклеиновой кислоты, в который эти мутации вводятся. Более или менее случайный мутагенез имеет место, в частности, при инкубации нуклеиновых кислот с химическими мутагенами или осуществлении их синтеза с помощью ДНК-полимераз с ослабленной специфичностью в отношении субстра-тов-предшественников. Совокупность этих подходов активно используется при проведении направленной эволюции белковых молекул. Вторая группа методов, получившая название направленного или сайт-специфического мутагенеза, обеспечивает введение мутаций в строго определенные участки нуклеиновых кислот, что позволяет заменять отдельные аминокислотные остатки в кодируемых этими молекулами белках и ферментах. Направленный мутагенез является сердцем (но не мозгом) рационального дизайна и редизайна белковых молекул, к рассмотрению которого мы сейчас переходим. [c.278]

Развитие генной инженерии облегчило процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения конкретных мутаций на основе генно-инженерных подходов называют направленным, или сайт-специфическим мутагенезом. Прообразом направленного мутагенеза является простая инкубация клонированного гена с химическими мутагенами in vitro, которая приводит к четкой локализации возникающих мутаций в пределах этого гена. В настоящее время разработано много эффективных методов сайт-специфического мутагенеза, позволяющих сознательно производить мутационные замены конкретных нуклеотидов. Получение заранее определенных мУ таций в сегментах рекомбинантных генов, введение мутантных [c.286]

Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I применяют также для синтеза второй нити кДНК (см. с. 182). для определения последовательности нуклеотидов в ДИК по методу Сэнгера (см. гл. 9), для сайт-специфического мутагенеза ДИК с использованием синтетических олигонуклеотидов (см. гл. 8). Скорость работы этого фермента т vitro при оптимальных условиях - около 30 нуклеотидов в секунду. [c.178]

Центромеры разных хромосом дрожжей функционально взаимозаменяемы, несмотря на определенные различия их первичной структуры. Снижение активности центромеры в результате сайт-специфического мутагенеза или делетирования одинаково проявляются в нарушении митоза и мейоза ARS плазмид, искусственных (YA ) и природных хромосом ( larke, 1998). Митотическая стабильность рекомбинантных структур с центромерой (типа YR p и YA ) на два порядка ниже стабильности природных хромосом. [c.68]

Сайт-специфический мутагенез области, примыкающей слева к гену ALB крысы, и определение влияния мутаций на эффективность транскрипции позволили выявить шесть консервативных последовательностей, которые входят в базальный промотор и обусловливают его тканеспецифичность (рис. 8.40). Базальный промотор составляют два элемента последовательность ТАТА, задающая точку начала транскрипции, но не влияющая на [c.66]

Сравнение некоторых изометимеров (метилаз, узнающих идентичные нуклеотидные последовательности) позволило в вариабельных участках выделить схожие последовательности, которые, как предполагается, ответственны за узнавание субстрата [74,361]. Методами сайт-специфического мутагенеза показано, что в мультиспецифических фаговых метилазах эти последовательности являются непрерывными участками длиной 40—50 аминокислот, расположенными тандемно [72, 74, 153, 395]. Таким образом, вариабельность специфичности метилаз обеспечивается комбинациями узнающих участков в главном остове, в котором сосредоточены узлы связывания Адо-мет и введения СНз-группы в 5-ое положение цитозина. [c.115]

Существуют разные способы внесения мутаций В клонированные фрагменты или небольщие геномы, НО мы рассмотрим лищь немногие из них. Во всех случаях успех зависит от двух условий. Во-первых, должна быть хорощо известна структура ИСХОДНОЙ ДНК. Как минимум, необходимо знать подробную карту сайтов рестрикции, но еще лучще, если известна вся последовательность изучаемого фрагмента. Во-вторых, поскольку все методы дают некую смесь продуктов, нужный элемент следует очистить с помощью клонирования, амплифицировать и охарактеризовать. Нри некоторых типах мутагенеза мутации образуются в случайных местах, при других—в определенных сайтах о последних говорят как о сайт-специфических (или сайт-направленных) мутациях. [c.343]

Химический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработюг сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарущения в структуру дуплекса (рис. 7.33, А). При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ полу- [c.344]

Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олиго-дезоксинуклеотиды можно синтезировать в больщих количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные методы получения сайт-специ-фических точечных мутаций в клонированных сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим олигодезоксирибонукле-отидом, содержащим мутантную последовательность, и комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей соответствующий сегмент дикого типа (рис. 7.36). Для этого ген, в котором мы хотим получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают [c.347]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология