Поглощение альдолазы

В спектрофотометрическую кювету помещают 2 мл 0,1 М триэта- ноламинового буфера, pH 8,0, глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу (30 единиц активности), а также растворы фруктозо-1,6-дифосфата (0,2 мМ), НАД+ (3 мМ) и арсената натрия (5 мМ) с таким расчетом, чтобы после доведения объема пробы до 3 мл их конечные концентрации соответствовали величинам, указанным в скобках. После переме-щивания начинают реакцию добавлением 30—50 мкл раствора альдолазы. Отмечают нарастание поглощения при 340 нм. [c.248]

Агарозу помещают на стеклянный фильтр и промывают сначала бидистиллированной водой, а затем 0,1 М На-фосфатным буфером, pH 7,4. К суспензии агарозы, количество которой эквивалентно 1 г сухого веса носителя, добавляют 1 мл раствора альдолазы, содержащего фермент в концентрации 1 мг/мл. Предварительно альдолазу обессоливают на колонке с сефадексом 0-50 в указанном буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА. Инкубацию проводят 10 мин при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании на магнитной мешалке. Добавляют глицин до конечной концентрации 70 мМ и инкубируют смесь в течение 2 ч при комнатной температуре и перемешивании. Агарозу промывают указанным буфером с ЭДТА до полного исчезновения в элюате глицина и белка. Отсутствие глицина контролируют по реакции с нингидрином (с. 131). Белок определяют по поглощению при 280 нм. Полученный препарат хранят в холодильнике. [c.390]

К первому типу относятся фотореактивирующий энзим (фотолиаза) и альдолаза. Фотолиаза комплексируется с субстратом (содержащие димеры нити ДНК) в темноте, но для самого ферментативного акта требуется поглощение квантов света (см. гл. ХУИ). В случае альдолазы каталитическую реакцию ускоряет свет, поглощаемый фермент-субстратным комплексом. [c.270]

Эти методы используются и в тех случаях, когда непосредственных спектральных изменений в смеси не происходит, но продукт ферментативной реакции участвует в другой реакции, которая уже идет с изменением поглощения. Например, альдолаза катализирует превращение фруктозо-1,6-дифосфата в глицеральдегид-З-фос-фат и дигидроацетонфосфат. Глицеральдегид-З-фосфат-дегидроге-наза восстанавливает НАД , и появление НАД-Н сопровождается изменением поглощения при 340 нм. TaKHjw образом, альдолазу можно определить по кинетике появления НАД-Н в присутствии избытка фруктозо-1,6-дифосфата, глицеральдегид-З-фосфат-дегид-рогеназы и НАД (рис. 5.4). Восстановление НАД или окисление НАД-Н осуществляется в ходе большого числа метаболических реакций. Все описанные измерения можно проводить на довольно дешевых спектрофотометрах, работающих в спектральном диапазоне до 340 нм, и даже пользоваться стеклянными кюветами. Поскольку НАД и НАД-Н сравнительно дороги, лучше иметь кюветы тоньше 1 см. [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология