Зонды радиоактивно меченные

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как Р или Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК [c.308]

Момент мечения ДНК-зондов, очевидно, выбирают так, чтобы можно было использовать Р-нуклеотиды с наивысшей удельной активностью. Введение метки имеет много недостатков, в частности, ее радиоактивность может быть опасна для здоровья. Однако еще важнее, видимо, то, что время полураспада составляет всего 14 дней, поэтому зонды приходится метить заново каждые 1-2 недели. Использование нерадиоактивных меток в ДНК-зондах позволит преодолеть многие из этих недостатков и разработать диагностические наборы для определения нуклеотидной последовательности ДНК мутантных генов, вирусов, микроорганизмов и т.д. [c.75]

Рис. 4-65. Два ферментативных метода, используемые обычно для получения радиоактивных молекул ДНК. Д ДНК-полимеразой I метят все нуклеотиды в молекуле ДНК, что позволяет получить высокорадиоактивные ДНК-зонды. Б. Полинуклеотид-киназа метит только 5 -концы ДНК. Если мечение ДНК сочетают с обработкой рестрикционной нуклеазой, как указано на рисунке, фракция молекул ДНК, содержащих меченные по 5 -

ДНК метится с помощью киназы только одним атомом Р, молекулы ДНК обычно недостаточно радиоактивны, чтобы использоваться в качестве зондов ДНК однако то, что помеченными цепи ДНК оказываются только по одному концу, делает их очень удобными для секвенирования и футпринтирования , что будет обсуждаться ниже. [c.233]

Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В пфвом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е соИ вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65, А). При этом получают радиоактивные ДНК-зонды , используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе ффмент полинуклеотид киназа из бактериофага используется для пфеноса отдельных фосфатов, меченных Р, с АТР на 5 -конец каждой из цепей ДНК (рис. 4-65, Б). Поскольку каждая из цепей ДНК метится с помощью киназы только одним атомом Р, молекулы ДНК обычно недостаточно радиоактивны, чтобы использоваться в качестве зондов ДНК однако то, что помеченными цепи ДНК оказываются только по одному концу, делает их очень удобными для секвенирования и футпринтирования , что будет обсуждаться ниже. [c.233]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология