РНК-зонды

Таблица 1.2. Синтез РНК-зондов

Рис. 4. Выявление единичных нуклеотидных замен методом ДГГЭ. Меченый одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд смешивают с двухцепочечной (клонированной, геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК смесь нагревают для разделения цепей. Происходит отжиг зонда с комплементарной ему цепью тестируемого фрагмента, при этом образуются гибридные дуплексы. Если в исследуемом образце имеется мутация, то в гибриде будет однонуклеотидный неспаренный участок. После отжига к смеси добавляют избыток одноцепочечной кольцевой ДНК, комплементарной зонду, для удаления его остатков. Проводят электрофорез смеси в денатурирующем градиентном геле. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Наличие неспаренных участков в мутантных образцах ДНК, изменяющих характер плавления, приводит к тому, что эти фрагменты оказываются в геле ближе к старту вследствие пониженной термостабильности. Преимущество такого метода разделения мо- чекул с неспаренными участками в его повышенной разрешающей способности.

РНК-зонды могут быть использованы вместо ДНК-зондов во всех случаях, причем обычно с минимальными модификациями методики. Большая стабильность РНК-РНК-дуплексов мо- [c.13]

В этой главе рассматриваются методы синтеза и использования в экспериментальных целях РНК, полученной in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ. Основное внимание мы уделили использованию радиоактивных РНК-зондов для рутинного анализа нуклеиновых кислот и не пытались изложить, кроме как в самых общих чертах, более специальные аспекты их применения, например для гибридизации in situ, в качестве смысловой мРНК или трансляционных матриц. По таким вопросам мы постарались дать ссылки на ключевые работы, которые позволят хорошо разобраться в технических возможностях этих методов. [c.12]

РНК-зонды, как правило, одноцепочечные молекулы, и их денатурация перед применением не требуется. Поскольку в исследуемом материале, как правило, присутствует множество различных НК, зонд должен вначале отыскать в этой сложной смеси своего комплементарного партнера и только потом образовать с ним комплекс. [c.96]

Уникальные свойства РНК-зондов [c.13]

Метод получения высокоспецифичных полноразмерных РНК-зондов приведен в табл. 1.2, а метод определения включения нуклеозидтрифосфатов в РНК — в табл. 1.3. [c.21]

Останавливают реакцию и удаляют матрицу обработкой ДНКазой. Неясно, необходим ли этот этап, если учесть, что матрица не подвергается денатурации ни на одной из стадий получения зонда. Кроме того, существует опасность разрушения зонда примесями РНКазы. Присутствие ДНК-матрицы при гибридизации в растворе может мешать гибридизации лишь при температурах, близких к температуре плавления (Т л) ДНК, когда ее цепи могут па отдельных участках начать расходиться и вступать во взаимодействие с РНК-зондом, защищая его от воздействия РНКазы и тем самым искажая результаты опыта. [c.25]

В этом разделе рассматриваются основные методы использования РНК-зондов при исследовании нуклеиновых кислот в обычной лабораторной практике. В раздел включены детальные описания методов, в которых РНК используются вместо ДНК-зондов при Саузерн- и нозерн- гибридизации и в опытах по защите от действия РНКазы. [c.27]

Использование РНК-зондов в экспериментах по защите от действия РНКазы позволяет точно рассчитать содержание Б клетке защищающей РНК- Пример такого расчета приведен в табл. 1.8. [c.33]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста, гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть высокоспецифичными. Другими словами, необходимо, чтобы зонд гиб-ридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствие последова-тельности-мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последователь-ности-мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижается. Специфичность зондов может проявляться на разных уровнях они могут различать два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза, клонированные интактные гены или их фрагменты. [c.188]

Используя РНК в качестве зонда в эксперименте по реассоциации, можно определить, какие последовательности генома представлены в мРНК. Очень небольшое количество радиоактивной РНК (или ДНК) вносят в реакцию вместе с существенно большим количеством клеточной ДНК. Поскольку ДНК клетки присутствует в огромном избытке, ее часть, образовавшая гибриды с РНК-зондом, не изменит концентрации последовательностей одноцепочечной ДНК. Определяющим фактором реакции является реассоциация комплементарных цепей ДНК клетки (т.е. как будто РНК-зонд отсутствует). Такие реакции называют реакциями, определяемыми концентрацией ДНК. Реассоциацию всей ДНК определяют обычными способами (по изменению оптической плотности раствора или по связыванию с гидроксиапатитом). [c.231]

Как же определить, имеем ли мы дело с множеством копий одного гена или с прерывистым геном Обычно для решения этой проблемы используют зонды, полученные из субклонов, содержащих последовательности, соответствующие только определенным областям мРНК. Такие последовательности получают путем разрезания клонированной кДНК на 5 - и З -области подходящей рестриктазой (т.е. такой, которая вносит разрыв в нужное место последовательности, соответствующей мРНК.) Затем такие специфичные по отношению к концам РНК зонды по отдельности повторно клонируют в других плазмидах. [c.251]

Где располагаются блоки сателлитной ДНК Развитие техники гибридизации нуклеиновых кислот позволило определить расположение последовательностей сателлитной ДНК непосредственно в хромосоме. При гибридизации in situ или цитологической гибридизации хромосомную ДНК денатурируют, обрабатывая клетки, распластанные на покровном стекле. Затем к препарату добавляют радиоактивный ДНК- или РНК-зонд. Зонд гибридизуется с комплементарными ему участками денатурированного генома. Расположение участков гибридизации можно определить с помощью радиоавтографии. [c.301]

Первым ферментом, широко использовавшимся для синтеза РНК-зондов, стала РНК-полимераза фага SP6 [4]. Это в основном было обусловлено исключительно высокой стабильностью фермента и возможностью получать его в больших количествах с помощью простых методов — в отличие от ферментов фагов Т7 и ТЗ. Однако генетическая организация фагов Т7 и ТЗ исследована достаточно полно, что дало возможность получить их ферменты путем экспрессии клонированных генов, и сейчас они легко доступны. Принцип использования фаговых РНК-полимераз идентичен для всех трех ферментов (рис. 1.1). Обычно полимеразы применяются для транскрипции линейных матриц, но существует и другой подход, основанный на таком природном свойстве этих ферментов, как преждевременная тер-минацня цепи в присутствии низкой концентрации нуклеозид-трифосфатов. Достоинство этого подхода состоит в том, что он не требует линейной матрицы, однако получаемые при этом молекулы-зонды имеют разную длину, что делает их непригодными для работы при использовании приводимых здесь методик. [c.13]

РНК-зонды обладают всеми преимуществами одноцепочечных ДНК-зондов это отсутствие конкурентной гибридизации молекул зонда друг с другом, высокая удельная радиоактивность по сравнению с продуктом ник-трансляции и не представляющее трудностей определение длины молекул. Дополнительное преимущество этих зондов по сравнению с одноцепочечной ДНК — большая простота их получения. Транскрипты можно отделить от матрицы путем ее ДНКазного расщепления и фенольной экстракции, тогда как получение одноцепочечных ДНК-зондов требует более трудоемкой процедуры выделения их из геля. В то же время РНК-зонды в большей степени подвержены деградации, чем соответствующие им ДНК-зонды, и об этом нельзя забывать. Самая распространенная проблема, встающая при использовании РНК-зондов, — неоднозначность интерпретации в случае получения отрицательного результата. [c.13]

Протекторный эффект при использовании РНК-зондов в опытах по защите от во.здействия РНКазы равноценен наблюдаемому эффекту для одноцепочечпых ДНК-зондов [10] РНК-зонды пригодны также нри использовании нуклеазы 51 или нуклеазы из проростков золотистой фасоли. П ш гибридизации Б растворе РИК-зонды будут защищать от нуклеазного расщеп- [c.14]

При гель-электрофорезе меченых транскриптов было обнаружено, что сами матрицы различаются по способности давать полноразмерные транскрипты. Даже в условиях такой низкой концентрации нуклеозидтрифосфатов, как 4 мкМ, при использовании в качестве матрицы ДНК гена hprt-ыышк синтезируется значительное количество полноразмерной РНК-зонда, тогда как на ДНК гомео-бокса при концентрации нуклеозидтрифосфатов 15 мкМ полноразмерных транскриптов почти не синтезируется (И. Дж. Джексон, неопубликованные данные). [c.24]

Проведите реакцию гибридизации на фильтре размером 15X20 см в 10 мл раствора, использовавшегося для предварительной гибридизации, в который дополнительно внесено Ю имп/мин/мл Р-меченной РНК-зонда, Инкубируйте при 50 °С 17 ч (в течение ночи) или более длительное время. [c.28]

При использовании РНК-зондов не требуется вносить какие-либо изменения в условия фракционирования в геле и переноса на нитрицеллюлозные или найлоновые мембранные фильтры. [c.28]

Использование РНК-зондов в блот-гибридизации по Саузерну, по-видимому, увеличивает чувствительность метода — главным образом из-за отсутствия конкурентной гибридизации зонда на себя , препятствующей гибридизации зонд—мищень (такая же чувствительность может быть достигнута и при использовании кДНК или других одноцепочечных ДНК-зондов но такие зонды, как правило, сложнее получить). [c.29]

В случае Нозерн -гибридизации РНК-зонды оказались гораздо более чувствительными, чем ДНК-зонды. Мелтон и др. [5] сообщали о достигнутом ими 10-кратном повышении чувствительности метода при использовании РНК-зондов как выяснилось, это общее правило. РНК-РНК-гибриды более стабильны в растворах формамида, чем аналогичные ДНК-ДНК-гибриды, что и порождает проблему неспецифичности гибридизации. В частности, связывание некоторых зондов, обладающих способностью к перекрестной гибридизации с рибосомной РНК, стало серьезной проблемой, и для выявления специфических гибридов приходится варьировать степень жесткости отмывки. В общем случае лучше с осторожностью относиться к полосам РНК, по размеру совпадающим с 28- или 185-РНК, до тех пор, пока не будут получены еще и другие доказательства того, что они появились в результате специфической гибридизации. Для удаления неспецифических гибридов некоторые исследователи предлагают проводить отмывку в присутствии РНКазы. В этом случае фильтры нельзя использовать повторно. [c.30]

Наилучшие результаты скрининга мы получали с РНК-зон-дами, приготовленными с помощью РНК-полимераз фагов 5Р6 или Т7 (см. гл. 1 и разд. 2.3.3, табл. 2.11), однако следует предпринять меры против деградации зонда. Мы обычно используем реакцию с 5Р6- или Т7-полимеразами с достаточным количеством зф-иТР и ДНК-матрицы для получения 30—80% включения в РНК. Реакцию останавливают однократной экстракцией хлороформом, РНК осаждают изопропанолом, а осадок ресус-пендируют в небольшом объеме буфера ТЭ, содержащего ванадил-нуклеотидный комплекс (ВНК) в концентрации 10 мМ. При этом удалять невключенные нуклеотиды не требуется. Не дена-турируйте РНК-зонд до использования. [c.53]

Гибридизация проводится в 2,5— 3 мл овежего буфера на фильтр. Буфер того же состава, что и в п. 2, но дополнительно содержит 10 имп./мин на 1 мл соответствующей Р-меченной РНК- или ДНК-зонда. Для РНК-зонда к смеси добавляют 10 мМ ВПК и гибридизуют 17 ч при 50 °С. ДНК-гибридизацию проводят 2 дня лри 42 °С. На стадии предварительной гибридизации мы обычно вводили в качестве конкурирующей ДНК денатурированный космидный вектор в концентрации 0,5—1 мкг/мл. [c.55]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

РНК-зонды очень эффективны для скринирования библиотек — они дают более сильный сигнал, чем меченые двухцено-чечные ДНК, хотя, несомненно, более чувствительны к деградации. Условия гибридизации детально описаны в разд. 2.2.7. [c.67]

Синтез равномерно меченного одноцепочечного РНК-зонда с использованием транскрипции in vitro клонированного фрагмента ДНК. [c.124]

Рис. 1. Метод РНКазного расщепления. Равномерно меченный одноцепочечный РНК-зонд транскрибируется с клонированной ДНК-матрицы. Зонд смешивают с двухцепочечным тестируемым фрагментом клонированной (геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК, и смесь нагревают для разделения цепей. Проводят отжиг РНК-зонда с комплементарной ему последовательностью в тестируемой ДНК и получают гибридные дуплексы. Если во фрагменте ДНК имеется единичная нуклеотидная замена, то в гибриде РНК—ДНК окажется однонуклеотидный неспаренный участок. Реассоцнированный образец обрабатывают РНКазой А, которая расщепляет цепь РНК по неспаренным участкам. Отметим также, что РНКаза А удаляет выступающие 3 - н 5 концы дуплекса. Дуплекс обрабатывают денатурирующими веществами для разделения цепей, затем проводят электрофорез в денатурирующем (сиквенсном) геле и фрагменты РНК фракционируют по размеру. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Если в тестируемой ДНК нет мутаций, на радиоавтографе наблюдается одна полоса, соответствующая по размеру длине

Оптимальными, на наш взгляд, являются РНК-зонды и соответственно исследуемые на однонуклеотидные замены участки ДНК длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. В этом случае и сам зонд, и продукты его расщепления легко выявляются при помощи денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, аналогичном используемому при секвенировании ДНК. При этом отношение сигнала к фону достаточно высоко для получения четких результатов. Совсем нетрудно наработать меченые одноцепочечные РНК-зонды гораздо большей длины, но результаты обработки таких длинных цепей РНКазой неоднозначны. Еще одна проблема, которая возникает при использовании зондов с длиной цепи более 1000 п. н., заключается в том, что под действием РНКазы наряду с расщеплением РНК—ДНК-дуплексов по неспаренным участкам может происходить (хотя и редко) расщепление цепи РНК по комплементарно спаренным участкам дуплекса. Кроме того, анализ продуктов расщепления длинных РНК-зондов (>-1000 п.н.) требует проведения денатурирующе- [c.127]

ГО электрофореза в агарозном геле. При этом в ряде случаев не удается полностью разделить гибриды РНК—ДНК и результаты получаются противоречивыми, так как фрагменты РНК, полученные при расщеплении ее по неспаренным участкам, но оставшиеся связанными с ДНК, обнаруживаются в геле в зонах, соответствующих длине всего зонда. Для более эффективного выявления единичных нуклеотидных замен путем РНКазного расщепления мы использовали по несколько зондов в каждой реакции отжига/расщепления. Однако полученные таким способом результаты зачастую очень неоднозначны и с трудом поддаются интерпретации. В силу перечисленных причин при исследовании фрагментов ДНК на единичные замены мы бы рекомендовали использовать в реакциях РНКазного расщепления РНК-зонды длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. [c.128]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология