Блот-гибридизационный анализ

Титр вируса в культуральной среде инфицированных клеток можно определить с помощью целого ряда методик, в основе которых лежат физические, биохимические или биологические методы анализа. Наибольшее распространение получил способ, заключающийся в количественном определении вирусной геномной РНК в культуральной среде с помощью гибридизации с меченным ДНК-зондом. Эту стандартную процедуру дот-блот-гибридизационного анализа проводят после концентрирования препарата вируса, как описано в табл. 9.4. Количественное определение достигается путем сравнения интенсивности полученного гибридизационного сигнала с интенсивностью контрольных сигналов гибридизации точно титрованного вируса (разд. 9.6.1.3) или известных количеств РНК, или ДНК, нанесенных на фильтр. Используя разные ДНК-зонды, можно оценить концентрацию индивидуальых компонентов в вирусном препарате и непосредственно определить, содержит ли вирус интересующие нас последовательности. [c.297]

Ретровирусные векторы имеют тот серьезный недостаток, что все они генетически нестабильны. Это может проявляться либо в форме массированных делеций, которые легко обнаруживаются с помощью блот-гибридизационного анализа, либо в виде точ-ковых мутаций, которые труднее детектировать и потому они более коварны. По всей видимости, РНК-полимераза и обратная транскриптаза, реплицирующие вирусный геном, не обладают сколько-нибудь заметной корректирующей активностью и частота спонтанных мутаций у ретровирусов необычайно высока [14, 20]. По имеющимся оценкам, частота мутирования ретровирусных векторов достигает 0,5% в расчете на каждый цикл [c.304]

Рис. 10.11. Блот-гибридизационный анализ мышиной высокомолекулярной ДНК, выделенной из тканей хвоста. ДНК выделяли из одиннадцати мышей, которые развились из оплодотворенных яйцеклеток, переживших инъекцию человеческой ДНК (фрагмент гена -fos). Выделенную ДНК расш,епляли рестриктазой Psu, фракционировали электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с -fos-зои-дом. Стрелками указаны детектируемые эндогенные мышиные (М) и экзогенные человеческие (Ч) фрагменты -fos.

Блот-гибридизационный анализ перестроек ДНК трансгенов также показал, что одни и те же гибридизационные сигналы детектируются с помощью зондов, полученных из разных переносимых конструкций. Эти наблюдения, взятые вместе, свидетельствуют о рекомбинации между экстрахромосомными трансгенами и указывают на высокий уровень активности рекомбинационной системы ранних эмбрионов шелкопряда. Можно предположить, что такая активность локализована в области полярной плазмы ранних эмбрионов (стадия синцициальной бластодермы) шелкопряда, в которую производились микроинъекции ДНК. [c.228]

Принимая во внимание накопленный экспериментальный материал, мы заключили, что обнаружение экстрахромосомных экзогенных ДНК в бабочках Fq представляло собой закономерный исход всех экспериментов по трансгенезу на тутовом шелкопряде и происходило с вероятностью 5%, равной вероятности получения трансгенного шелкопряда в результате единичной микроинъекции. Но и эта сравнительно небольшая вероятность получения трансгенных особей представляется значительной, если принять во внимание отсутствие во вводимых рекомбинантных конструктах ori / ARS-элементов. Наличие в бабочках Fq экстрахромосомной экзогенной ДНК, прошедшей (по минимальной оценке) Ю -кратную репликацию, предполагает, что введенные молекулы ДНК приобрели подобные элементы за счет внутренних перестроек или за счет рекомбинации с молекулами фракции эндогенной экстрахромосомной ДНК шелкопряда (рис. 83 и 84). В обоих случаях экзогенные рекомбинантные ДНК должны были бы претерпеть структурные перестройки, что и показал блот-гибридизационный анализ. Одним из важных его результатов явилось обнаружение гомологичной геному шелкопряда дополнительной ДНК в составе автономных трансгенов уже в особях-основателях трансгенных линий (рис. 84). [c.228]

Рис. 83. Обнаружение нестабильных экстрахромосомных трансгенов тутового шелкопряда, образовавшихся после переноса рекомбинантной экзогенной ДНК в ранние эмбрионы с помощью блот-гибридизационного анализа (Николаев и др., 1989)

Рис. 85. Обнаружение и характеристика экстрахромосомных трансгенов мышей Р2-поколе-ния, потомков основателя № 1, полученного после переноса в пронуклеус мыши плазмиды рг8а с помощью блот-гибридизационного анализа (Nikolaev et al., 2003)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология