Олигонуклеотиды определение нуклеотидной последовательности

Рис. 5.24. Синтез генов с помощью ПЦР. Перекрывающиеся олигонуклеотиды (А и В) отжигают и достраивают образовавщийся дуплекс с заглубленными 3 -гидроксильными концами. Двухиепочечные молекулы денатурируют, добавляют в реакционную смесь вторую пару олигонуклеотидов (Си О), перекрывающихся с продуктами первого раунда ПЦР, и отжигают. Осуществляют второй раунд ПЦР, добавляют следующую пару олигонуклеотидов (Е и Р), осуществляют третий раунд ПЦР и т. д. В результате образуется двутсцепочечная ДНК, идентичная искомому гену. Одинаковыми буквами со щтрихом или без (А и А, В и В и т. д.) обозначены комплементарные участки ДНК. Нуклеотидная последовательность каждого олигонуклеотида соответствует таковой определенных сегментов ДНК.

Полученные тем или иным путем олигонуклеотиды разделяют методами противоточного распределения, хроматографии и другими, а затем проводят определение нуклеотидной последовательности индивидуальных олигонуклеотидов. [c.389]

Для определения нуклеотидной последовательности в олигонуклеотидах их гидролизовали нуклеазами, как это будет описано далее, и затем идентифицировали нродукты гидролиза. Для анализа нуклеотидов, полученных нри гидролизе РНК рибонуклеазой Ti, наиболее пригодна панкреатическая РНК-аза, и, наоборот, если РН1 гидролизовали панкреатической РНК-азой, для анализа полученных нуклеотидов использовали рибонуклеазу Ть В обоих случаях конечные продукты гидролиза одинаковы они содержат мононуклеотиды Г, Ц и У и олигонуклеотиды с разным числом остатков А, имеющие на З -конце Г, Ц, или У. Большинство этих продуктов можно разделить с помощью электрофореза нри pH 3,5 (фиг. 3). [c.64]

Как и в других обзорах на эту тему, описание методов разделения построено по традиционной схеме от сравнительно простых соединений (азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов) к все более сложным — олигонуклеотидам и различным классам РНК и ДНК- В заключительных разделах основное внимание уделено использованию хроматографии и электрофореза при определении нуклеотидной последовательности и для разделения нуклеопротеидов. Как правило, вначале описываются методы хроматографии, а затем — электрофореза. Этот обзор не претендует на роль исчерпывающей монографии, он скорее дает оценку современному состоянию исследований в данной области, акцентируя внимание на достижениях последних нескольких лет. Во многих случаях приведены примеры использования конкретной методики с целью проиллюстрировать ее возможности. [c.162]

Вторая особенность электрофореза нуклеиновых кислот и их фрагментов — очень широкий диапазон молекулярных масс. Например, при определении нуклеотидной последовательности ДНК или РНК приходится разделять полученные при их гидролизе олигонуклеотиды, содержащие единицы и десятки мономерных звеньев, т. е. молекулы с массами от тысячи до нескольких сотен тысяч дальтон, а это — тот же диапазон, что для белков и пептидов. Естественно, что электрофорез при этом ведут в ПААГ с концентрацией от 5 до 20%, в зависимости от конкретной задачи. С другой стороны, электрофорез можно успешно использовать для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и даже целых молекул ДНК или РНК вирусов. В этих случаях электрофорез ведут в гелях агарозы. [c.121]

Первым таким меченым зондом служит синтезированный олигонуклеотид, комплементарный участку секвенируемой ДНК с известной последовательностью. Следующий, очередной зонд подбирают на основе уже определенной в предыдущем цикле нуклеотидной последовательности. Причем синтез такого олигонуклеотида, комплементарного той или иной цепи, позволяет осуществлять как секвенирование нового участка, так и подтверждающее секвенирование в обратном направлении. [c.239]

Специфичность протекания ПЦР зависит от массы обстоятельств, среди которых не последнюю роль играет и длина олигонуклеотидных праймеров (не говоря уже об их последовательности ). Обычно используемые для ПЦР праймеры варьируют по длине от 15 до 22 нуклеотидных звеньев, впрочем, они могут быть как значительно короче, так и заметно длиннее. При этом количества возможных комбинаций всех четырех нуклеотидов в олигонуклеотидах определенной длины [c.37]

Продукты окисления первичной спиртовой группы в олигодезоксинуклеотидах достаточно легко претерпевают р-элиминацию с расщеплением фосфодиэфирной связи(см. стр. 66) эта реакция была предложена для определения нуклеотидной последовательности в дезоксиолигонуклеотидах, примыкающей к З -концу. Еще легче протекает расщепление в олигодезоксинуклеотидах, содержащих на 5 -конце цепи остаток З -кетонуклеозида. В этом случае образование основания и олигонуклеотида, содержащего на одно звено меньше, чем исходный, происходит уже в процессе окисления [c.531]

Применяемые для определения нуклеотидной последовательности РНК методы сводятся к контролируемому раацеплению нуклеиновых кислот различными ферментами и последующему разделению продуктов гидролиза. Комбинируя подходящие наборы ферментов и изучая олигонуклеотиды, полученные на различных стадиях гидролиза, можно определить нуклеотидный состав каждого из нвх, восстановить последовательность нуклеотидов в исходной цепи, что помогает окончательно расшифровать нуклеотидную последовательность всей РНК. Таким образом была установлена первичная структура многих транспортных РНК и некоторых 5S-PHK. [c.38]

Олигонуклеотид 5 -GATTT A GGGTTGGGGTTT T-3 весьма удобен для определения последовательностей нуклеотидов в областях соединения гена GUS методом затравочного синтеза.-Данный олигонуклеотид, содержащий 22 нуклеотида, комплементарен участку кодирующей цепи гена GUS, который оканчивается через 14 п. н. после А инициаторного кодона ATG. При слиянии генов эту затравку можно успешно применять для определения нуклеотидной последовательности обеих цепей в мини-препаратах ДНК. Такой олигонуклеотид можно использовать и для анализа химерных транскриптов методом затравочного синтеза [6]. [c.366]

Достижения в области изучения первичной структуры нуклеиновых кислот непосредственно связаны с развитием методов фракционирования олигонуклеотидов. Ускорению этих исследований способствовало наличие очищенных препаратов РНК и рибонуклеаз, специфически расщепляющих одноцепочечную молекулу РНК. К настоящему времени установлена полная нуклеотидная последовательность многих РНК, в том числе многочисленных тРНК, 5S- и 5,8S-PHK, информационных и рибосомальных РНК. Работы по определению первичной структуры ДНК начались несколько позднее, однако благодаря использованию электрофоретических методов, позволяющих быстро анализировать смеси, они вскоре достигли того же уровня, что и исследования РНК. Стратегия установления первичной структуры нуклеиновых кислот описана во многих превосходных обзорах [5, 121—123]. В настоящем разделе особое внимание уделено методам электрофореза на бумаге и в геле, используемым для разделения рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. [c.188]

Нз клеотидная последовательность фрагмента ДНК, в пределах которой предполагается выбрать участок для синтеза праймера, должна быть уверенно прочитана . Следует исключить сомнительные последовательности, допускающие их неоднозначное прочтение . Преследуя цель синтеза минимального количества праймеров, необходимых для завершения определения нуклеотидной последовательности протяженного фрагмента ДНК, надо располагать новый праймер возможно близко к 5 -концу уже известной последовательности, но, как правило, чтобы его 3 -конец находился не ближе 20-50 нуклеотидов от края. Конкретное расположение места для отжига праймера во многом зависит и от особенностей самой последовательности ДНК, где надо принимать в расчет и ее G -состав, и возможные повторяющиеся элементы, и участки со значительной (потенциальной) вторичной структурой. Не последнюю роль при выборе праймера играет и температура отжига синтезируемых олигонуклеотидов, которая обычно рекомендуется в пределах 40°-50°С при предполагаемой использовании в качестве ДНК полимеразы секвеназы в 60°-70°С для термостабильных ДНК-полимераз. Кроме ОС-состава, температура отжига праймеров в значительной степени зависит и от их длины, обычно выбираемой в пределах 15-22 нуклеотидов. Для более точного определения температуры плавления олигонуклеотидов в расчет принимаются не только сами основания, но и их ближайшее окружение, что может быть проведено с помощью специализированных компьютерных программ, подробнее рассмотренных в соответствующей главе. Однако грубый подсчет температуры плавления праймеров может быть проведен вручную с помощью следующей формулы [c.62]

Ранее схожий метод мультиплексной геномной прогулки был применен для определения нуклеотидной последовательности неклони-рованного гена пируваткиназы Е. соИ [Ohara et al., 1989]. Суть такой прогулки , весьма напоминающей праймерную (описанную ниже в разделе 8.4), заключается в расщеплении тотальной ДНК несколькими подходящими рестрикционными эндонуклеазами, разделении полученных фрагментов в денатурирующем секвенирующем гель-электрофорезе, их переносе на нейлоновый фильтр и многочисленных гибридизациях с мечеными олигонуклеотидами (рис. 8.3). [c.239]

Независимо от типа праймерных молекул, представляющих собой или единый олигонуклеотид, или состоящих из отдельных модулей, общая стратегия секвенирования ДНК праймерной прогулкой , приведенная на рис. 8.21, остается неизменной. Некоторое отличие реально осуществляемых проектов от того, что приведено на данной схеме, и направленное на ускорение выполнения проекта по определению нуклеотидной последовательности ДНК, заключается в одновременном секвенировании вставки с обоих концов клонированного фрагмента или даже еще с какого-либо произвольного места вставки, что позволяет накапливать данные соответственно в два или три раза быстрее (кратность ускорения зависит от исходного числа точек, с которых начинается секвенирование и праймеров к ним). При этом праймерами для секвенирования краев вставки обычно служат стандартные секвенирующие праймеры, комплементарные соответствующим участкам векторной молекулы. [c.283]

Продолжающийся поиск альтернативных возможностей определения нуклеотидной последовательности ДНК привел к разработке принципиально нового метода секвенирования ДНК посредством гибридизации. В его основу было положено представление, что вся последовательность ДНК состоит из коротких подпоследовательностей. Знание порядка нуклеотидов в них, а также расположение этих подпоследовательностей друг относительно друга позволяют реконструировать весь исследуемый фрагмент ДНК. Принцип определения нуклеотидной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК этим методом основан на образовании Уотсон-Криковских пар в результате проведения этапа гибридизации фрагмента ДНК с набором олигонуклеотидных зондов. Анализ характера гибридизации конкретных олигонуклеотидов позволяет провести реконструкцию секвенируемого фрагмента ДНК. [c.400]

Несмотря на многообразие и высокую разделяющую способность методов, описанных в 7.1, они оказываются бессильными при решении задач по выделению индивидуальных компонентов из сложных биологических смесей. Уже отмечалось, что иммуноглобулиновая фракция сыворотки крови состоит из тысяч различных антител, которые весьма сходны по общей структуре, что не дает надежды разделить смесь на индивидуальные компоненты традиционными методами, основанными на различиях тех или иных физико-химических характеристик компонентов. Единственным заведомым отличием каждого индивидуального иммуноглобулина является его специфичное сродство к определенному антигену. То же самое имеет место в случае смеси мРНК, которые несущественно различаются по нуклеотидному составу. Тем не менее они имеют различные нуклеотидные последовательности и соответственно могут обладать селективным сродством к олигонуклеотидам или нуклеиновым кислдтам с комплементарными последовательностями. [c.246]

Щелочной гидролиз РНК до мононуклеотидов, хотя он и является одним из самых распространенных методов определения нуклеотидного состава РНК и часто применяется при установлении нуклеотидной последовательности и определении концевых звеньев в олигонуклеотидах (см. стр. 45), как аналитический метод имеет ряд существенных недостатков. В процессе щелочного гидролиза РНК происходит существенное дезаминирование производных цитозина и в еще большей степени З-Н-метилцитозина, разрушение производных 5,6-дигидроурацила (см. стр. 456), а также 7-М-метилпуринов и l-N-метилгипоксантина (см. стр. 440 и 442), перегруппировка производных l-N-метиладенина в б-экзо-Ы-метиладенины (см. стр. 450). Поэтому для анализа содержания этих соединений в составе РНК щелочной гидролиз непригоден. [c.559]

Для исследовапия нуклеотидных последовательностей акцепторного конца т-РНК в лаборатории Д. Г. Кнорре был применен кинетический подход. Подвергая т-РНК неполному перевариванию фосфодиэстеразой змеиного яда до различной глубины и изучая кинетику накопления мононуклеотидов, можно установить последовательность 8—ill концевых нуклеотидов. Для установления полной структуры молекулы т-РНК в этой же лаборатории С. К. Василенко был предложен очень интересный и перспективный метод. Для индивидуальной т-РНК составляется карта олигонуклеотидов, образующихся при полном ферментативном гидролизе таких т-РНК или панкреатической рибонуклеазой или гуанилрибопуклеазой. Затем та же РНК подвергается ферментативному расщеплению фосфодиэстеразой на различную глубину (от 10 до 80%). Для каждой фракции переваренной РНК составляется аналогичная олигонуклеотидная карта . Исчезновение определенных олигонуклеотидов в исходной карте делает возможным установить местоположение этих олигонуклеотидов в иолинуклеотидной цепи исходной молекулы т-РНК. [c.522]

Быстрое распространение хроматографических и электрофоретических методов в области исследования нуклеиновых кислот, которому в значительной степени способствовало становление технологии рекомбинантных ДНК, продолжается и по сей день, особенно в таких направлениях, как разделение мРНК, фрагментов ДНК и нуклеопротеидов. Уже установлена первичная структура обширных участков генома многих животных, и непрерывное совершенствование метода гель-электрофореза, обладающего высоким разрешением, в сочетании с использованием компьютерной техники для определения полных нуклеотидных последовательностей позволит добиться еще более значительных успехов. На ранних этапах развития этой области исследований одна из задач экспериментатора заключалась в том, чтобы приспособить используемые в других областях науки хроматографические и электрофоретические методы для разделения моно- и олигонуклеотидов. Теперь же, по прошествии тридцати лет, биохимия нуклеиновых кислот сама стала тем источником новых представлений о разделении макромолекул, который стимулирует развитие хроматографии и электрофореза. [c.196]

До того как появились современные методы определения последовательностей нуклеиновых кислот, эти ферменты использовали для расщепления РНК до олигонуклеотидов, анализом которых можно было определить нуклеотидную последовательность всей молекулы. В силу своей низкой специфичности они, по-видимому, ответственны за деградацию РНК in vivo. Этим может объясняться и то, какие типы концов они образуют. [c.311]

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Центральным элементом метода секвенирования ДНК-гибридиза-цией служит олигонуклеотидная матрица, или микрочип, на котором в строго определенных местах фиксированы конкретные олигонуклеотиды с известной последовательностью. Если для использования данного метода в диагностических целях можно ограничиться лишь несколькими конкретными олигонуклеотидами, то для секвенирования de novo необходимо иметь полный набор олигонуклеотидов, состоящий из 4 вариантов. При этом считается, что длина фрагмента ДНК, который можно просеквенировать в одном эксперименте, приблизительно равна квадратному корню из числа всех возможных олигонуклеотидов в данном наборе [Southem et al., 1992]. В работе Певзнера и соавт. [Певзнер и др., 1991] приведено приблизительное соотношение длины применяемых олигонуклеотидов в матрице и протяженности фрагмента ДНК, нуклеотидная последовательность которого может быть однозначно установлена. Так, например, около 2,5 тыс. нуклеотидов теоретически можно прочитать в одном эксперименте с помощью полного набора олигонуклеотидов, состоящих из 12 звеньев. Однако сама матрица при этом будет состоять из огромного числа 16 777 216 вариантов. Набор из 262 144 9-мерных олигонуклеотидов, хотя теоретически и позволяет однозначно определять нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК протяженностью около 500 нуклеотидов, в настоящее время слишком велик для изготовления подобной матрицы. Достаточно оптимальной можно считать матрицу с длиной олигонуклеотидов, равной 8 звеньям, что составляет всего 65 536 всех возможных вариантов таких молекул, изготовление которой также весьма не простой процесс. Приведенная на рис. 13.1 несколько упрощенная схема иллю- [c.403]

Смотреть страницы где упоминается термин Олигонуклеотиды определение нуклеотидной последовательности: [c.20] [c.171] [c.20] [c.89] [c.260] [c.118] [c.17] [c.248] [c.284] [c.205] [c.54] [c.590] [c.138] [c.171] [c.279] [c.406] [c.102] [c.127] [c.134] [c.198] [c.409] [c.51]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология