Трансформация бактерий сайт-специфическая

В последние годы разработана техника сайт-специфического мутагенеза, позволяющего вводить мутации в точно определенный участок гена. Другое название этого метода — олигонуклео-тиднаправленный мутагенез. Суть метода сводиться к следующему. Фрагмент ДНК, в котором желают получить мутацию, переводится в однонитевую форму, например, на векторе фага М13. Синтезируется олигонуклеотид размером 14—21 п.о. комплементарный области, в которую должна быть введена мутация. В центре олигонуклеотида располагают нуклеотид, не комплементарный исходной последовательности ДНК. Производят отжиг олигонуклеотида с кольцевой однонитевой ДНК. Затем с помощью ДНК-полимеразы и лигазы достраивают вторую цепь и замыкают кольцо (рис. 30, I). Чтобы облегчить получение кольцевых двуспиральных замкнутых форм ДНК, часто используют второй олигонуклеотид, что сокращает путь ДНК-полиме-разе. Кольцевые замкнутые формы ДНК затем очищаются и ими трансформируются бактериальные клетки. После трансформации такой кольцевой ДНК и раунда репликации в потомстве должны находиться формы, несущие родительскую и мутантную ДНК, в соотношении 1 1. Далее, отдельные колонии бактерий или негативные колонии фага используют для скрининга мутантных форм. [c.162]

Инсерционная трансформация с участием pTi. Механизм инсерционной трансформации плазмидой pTi отличается от механизма трансформации других эукариотических систем, описанных в данной главе, но имеет некоторое сходство с бактериальной конъюгацией. В хромосоме А. tumefa ieris закодирована информация о функциях, необходимых для прикрепления бактерий к клеткам растений. Плазмида pTi кодирует цис- и функции, нужные для интеграции. Для осуществления интефации Т-ДНК на правом ее конце должен присутствовать сегмент из 25 п.н. переносятся только те последовательности, которые расположены слева от этой области. Подобная же последовательность встречается на левом конце Т-ДНК. По-видимому, она не требуется для интеграции, но помогает обозначить конец интефируемой Т-ДНК. 7) йис-функции обеспечиваются продуктами v/r-генов (рис. 5.46). Среди них имеется сайт-специфическая эндонуклеаза, которая разрезает нижнюю цепь Т-ДНК в пределах обеих пофаничных последовательностей. З -конец ДНК pTi, ближайший к правостороннему разрезу, служит праймером для синтеза ДНК, замещающей нижнюю цепь Т-ДНК. Свободная цепь Т-ДНК переносится в растительные клетки, начиная с 5 -конца правой пограничной последовательности к З -концу. Механизм ее включения в случайные сайты ДНК клеток растений остается неясным. [c.275]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология