Применение синтезированных олигонуклеотидов

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Сделаны попытки применения твердофазных методов, разработанных 8 химии белка, для сщпеза олигонуклеотидов [38]. Однако обеспечить высокие выходы на каждой стадии соединения нуклеотидов труднее, чем при соединении пептидов, поэтому длина ц.епй, которую можно надежно синтезировать с помощьй твердофйЗиых методов, очень ограничена. [c.427]

Однако наиболее широкое применение находят сравнительно короткие олигонуклеотиды. Для того чтобы придать фрагменту нуклеиновой кислоты необходимые для встраивания в определенный участок векторной молекулы липкие концы, синтезируются так называемые линкеры, т. е. двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие последовательность, расщепляемую той или иной рестрикционной эндонуклеазой. Обычно в качестве линкеров применяются самокомплементарные олигонуклеотиды длиной 8—10 нуклеотидных звеньев. На рисунке 213 демонстрируются некоторые типы линкеров. [c.377]

К настоящему времени сделаны базисные разработки для выращивания клеток млекопитающих и есть все основания надеяться на то, что аппаратурное оформление биотехнологических процессов будет постоянно совершенствоваться. Как пример сказанному можно назвать геновый ассемблер, с помощью которого синтезируют олигонуклеотидные последовательности ДНК длиной около 200 оснований. Олигонуклеотиды "растут на твердых бусинках, помещенных в специальные кассеты, имеющие цветовой код (А/О Фармация, ЛКБ-приборы, Швеция). С применением уникальной кассетной системы (объемом О, 2, 1, 3 или 10 микромолей) исключается необходимость взвешивания матрицы перед [c.348]

Выходы целевого олигонуклеотида при использовании стехпометри-ческих количеств обоих компонентов уменьшаются с увеличением длины олигонуклеотидного компонента. Высокие выходы могут быть получены путем применения избытка мононуклеотидного компоненаа, причем с увеличением размеров олигонуклеотидной цепи избыток мононуклеотида должен соответственно возрастать. При проведении ступенчатого синтеза полинуклеотидов необходимо учитывать, что растворимость промежуточных соединений уменьшается с увеличением длины цепи. В связи с этим усложняются требования, предъявляемые к защитным группам. Этим методом синтезированы разнообразные тринуклеотиды [c.400]

Благодаря своей высокой эффективности и простоте направленное введение мутаций с использованием олигонуклеотидов по модифицированной методике Т.А. Кункеля до сих пор находит широкое применение [16, 17]. В этом подходе для направленного введения мутаций используют 20-25-звенный олигонуклеотид, комплементарный мутагенизируемому участку гена, который содержит все требуемые замены нуклеотидов. Мутагенизируемый ген или его участок клонируют в фагмидном векторе, в котором далее стандартными методами заменяют ряд остатков тимина на остатки уридина и переводят в одноцепочечную форму. Олигонуклеотид гибридизуют с такой кольцевой одноцепочечной ДНК и используют в качестве праймера для модифицированной Т7-ДНК-полимеразы (секвеназы), с помощью которой в присутствии обычных четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов синтезируют комплементарную цепь ДНК (рис. 33). [c.290]

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотид ных праймеров, комплементарных двум З -концам участков, офаничивающих ампли-фицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка НЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов (разд. 6.1.в). Для осугцествления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры. При творческом применении НЦР-метода он существенно дополняет методы молекулярной генетики, и если бы часть II книги не была фактически завершена до того, как этот метод был окончательно разработан, его основы были бы обязательно изложены в гл. 5-7. [c.360]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология