Эндонуклеазы сайт-специфические

У эукариотических клеток, по-видимому, отсутствует аналог бактериальной системы рестрикции-модификации. Хотя у эукариот имеется метилированная ДНК и по крайней мере у некоторых — сайт-специфические эндонуклеазы (см. гл. IV). они не образуют единую защитную систему. Таким образом, защита эукариотических клеток от вирусов основана на совершенно других механиз.мах. [c.133]

Сверхчувствительные сайты. Специфические участки ДНК, локализованные в области хроматина, увеличивающие чувствительность этой области к эндонуклеазам. Появление сверхчувствительных сайтов коррелирует с транскрипцией прилежащих участков ДНК эукариотической клетки. [c.315]

Рестриктазы — сайт-специфические эндонуклеазы, составляющие часть системы рестрикции-модификации. [c.499]

Индукция сайт-специфических точечных мутаций в одноцепочечных участках дуплексной ДНК с помощью бисульфита натрия. Одноцепочечный участок во вставке получали путем расщепления сверхспиральной дуплексной ДНК рестриктирующей эндонуклеазой в присутст- [c.346]

Разрезание ДНК на фрагменты Любая нативная ДНК может быть "измельчена" с помощью ферментов эндонуклеаз, среди которых особое место занимает рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы) Биологическая роль их, например, в клетках прокариот заключается в гидролизе чужеродной ДНК, проникающей в клетки извне Собственная хромосомная ДНК при этом остается незатронутой рестриктазами, что обусловлено наличием ферментов, называемых моди-фикационными мети-лазами, узнающими одинаковые с рестриктазами сайты Названные метилазы катализируют реакции метилирования А или Ц в немногих специфических сайтах в хромосомах, в результате чего метилированная ДНК оказывается нечувствительной к атаке рестриктазами Переносчиком метильных групп выступает S-адено-зил-Ь-метионин (SAM) [c.188]

Рестриктазы представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. Таким образом, при действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которого был выделен фермент, и [c.25]

Рестриктаза. Эндонуклеаза, расщепляющая обе цепи ДНК в строго определенных сайтах со специфической последовательностью оснований. Саузерн-блоттинг. Метод переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр с последующей гибридизацией с меченым зондом. Сигнал. Конечный этап визуализации определенного фрагмента ДНК (клона). Например, при радиоавтографии—темное пятно на рентгеновской пленке, соответствующее месту нахождения гибридного дуплекса, одна из цепей которого является радиоактивно меченным зондом. [c.51]

Принципы технологии рекомбинантных ДНК [2397 60 493]. Было выделено много рестриктаз (более 150), расщепляющих ДНК в специфических сайтах [117]. Например, эндонуклеаза RI рестрицирует двухцепочечную ДНК по двум сайтам таким образом, что образуются два липких конца [c.123]

Липкие концы различных молекул ДНК, расщепленных этим ферментом, могут вступать в комплементарное взаимодействие по четырем А—Т-парам. Рестрикционные эндонуклеазы различаются по тем сайтам в ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их применение для амплификации специфической ДНК, что необходимо для определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК или для изучения механизмов [c.123]

ДНК (гл. 2 и 32). Механизм ее действия в отношении неправильного основания схематически изображен на рис. 34.8. Из фосфодиэфирного остова основание удаляется, в результате чего образуется апуриновый сайт. Этот сайт специфически узнается АР-эндонуклеазой (АР символизирует отсутствие пурина или пиримидина в зависимости от конкретного фермента), которая вносит разрыв на 5 -стороне сайта. Затем могут следовать этапы эксцизионной репарации. [c.438]

При первых делениях аскоспоры тип спаривания переключается на противоположный пцд контролем гена НО (от англ. homo-thallism). Ген НО кодирует эндонуклеазу, которая производит двунитевой сайт-специфический разрез ДНК в локусе МАТ или МАТа в зависимости от того, какая аллель присутствует в этом локусе. Двунитевой разрез инициирует направленную конверсию, при которой генетическая информация кассеты HML i замещает информацию, содержащуюся в локусе МАТ (или HMR замещает информацию МАТа). При этом кассеты сохраняют содержащийся в них генетический материал, а генетический материал, находившийся в локусе МАТ, теряется. Такое переключение происходит только в двух клетках на стадии микроколонии, состоящей из четырех клеток. После этого клетки типа спаривания а копулируют с клетками типа спаривания а. Образуются диплоидные клетки, гетерозиготные по МАТ /МАТц, и ген НО выключается. Далее гетерозиготный диплоид стабильно размножается до нового мейоза и споруляции, после чего при изоляции аскоспор весь процесс в ходе их прорастания повторяется. [c.431]

Переключение типа спаривания инициируется сайт-специфической эвдонуклеазой (НО-эндонуклеазой), являющейся продуктом гена НО, Этот фермент делает двухцепочечный разрез в ДНК локуса МАТ, в результате эта область вырезается и затем ре синтезируется, при этом матрицей служит молчащий ген противоположного типа спаривания (рис. 10-30). Транскрипция гена НО, определяющего, когда и где происходит переключение, строго контр о Л1 у ется. С помощью генетического анализа было показано, что контроль обеспечивают по меньщей мере щесть регуляторных генов (от SWI 1 до SWI 6). В связи с тем, что при почковании дрожжевые клетки делятся асимметрично, одна из двух образовавшихся клеток больше ( материнская ), чем другая ( дочерняя ). Большинство материнских клеток в ходе дальнейшего роста переключает тип спаривания, а вновь образовавшиеся дочерние клетки (возникающие из почки) не синтезируют продукт гена НО и не способны переключаться до тех пор, пока г )и делении они не станут материнскими клетками (рис. 10-31). Асимметрия переключения оказалось связанной с асимметричным наследованием белка SWI 5, который Г5)исоединяется к ДНК перед геном НО и необходим для его транскрипции. Полагают, что белок SWI5 (либо его активная форма) наследуется лишь материнской клеткой Остается непонятным, почему этого белка нет в почке, но характер его наследования может служить моделью асимметричной сегрегации некоторых признаков, наблюдаемой у высших эукариот. [c.202]

Инсерционная трансформация с участием pTi. Механизм инсерционной трансформации плазмидой pTi отличается от механизма трансформации других эукариотических систем, описанных в данной главе, но имеет некоторое сходство с бактериальной конъюгацией. В хромосоме А. tumefa ieris закодирована информация о функциях, необходимых для прикрепления бактерий к клеткам растений. Плазмида pTi кодирует цис- и функции, нужные для интеграции. Для осуществления интефации Т-ДНК на правом ее конце должен присутствовать сегмент из 25 п.н. переносятся только те последовательности, которые расположены слева от этой области. Подобная же последовательность встречается на левом конце Т-ДНК. По-видимому, она не требуется для интеграции, но помогает обозначить конец интефируемой Т-ДНК. 7) йис-функции обеспечиваются продуктами v/r-генов (рис. 5.46). Среди них имеется сайт-специфическая эндонуклеаза, которая разрезает нижнюю цепь Т-ДНК в пределах обеих пофаничных последовательностей. З -конец ДНК pTi, ближайший к правостороннему разрезу, служит праймером для синтеза ДНК, замещающей нижнюю цепь Т-ДНК. Свободная цепь Т-ДНК переносится в растительные клетки, начиная с 5 -конца правой пограничной последовательности к З -концу. Механизм ее включения в случайные сайты ДНК клеток растений остается неясным. [c.275]

Химический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработюг сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарущения в структуру дуплекса (рис. 7.33, А). При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ полу- [c.344]

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага Х. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей (рис. 10.13, Ап Б). [c.218]

Эти ферменты являются компонентами системы рестрикции — модификации прокариотических клеток, которая предназначена для их защиты от чужеродных ДНК. К рестрикционным эндонуклеазам относятся также и все другие ферменты, специфически расщепляющие ДНК по определенной последовательности, хотя часто их роль в процессах рестрикции — модификации не доказана. В зависимости от характера узнаваемой нуклеотидной последовательности ( сайта ), мест расщепления и условий реакции ре-стриктазы делятся на три класса. [c.309]

Рестриктирующие эндонуклеазы. Эндодезоксирибонуклеазы, узнающие специфическую нуклеотидную последовательность и вызывающие расщепление обеих цепей ДНК в сайтах, которые определяются нуклеотидными последовательностями, обладающими симметрией второго порядка относительно центра. Эти ферменты являются важным инструментом генетической инженерии. [c.1018]

Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Подробно мы анализировали реакцию разрезания при обсуждении перспектив ее использования для картирования или реконструирования ДНК in vitro (гл. 3 и 19). Теперь мы рассмотрим вопрос о том, как выполняют эти ферменты свои природные функции. [c.432]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Эндонуклеазы рестрикции класса II, которые обладают уникальной способностью расщеплять ДНК по специфическим сайтам рестрикции, широко используются в генной инженерии (см. раздел 2.1 в первой части книги). Кроме того эти ферменты являются излюбленным объектом фундаментальных исследований, в ходе которых предпринимаются попытки объяснения их высокой специфичности. В настоящее время имеются данные рентгеноструктурного анализа, по крайней мере, для 12 рестриктаз, в том числе свободных ферментов, а также ферментов в комплексе с ДНК, содержащими соответствующие сайты рестрикции, и неправильными ДНК-субстратами. Среди этих ферментов эндонуклеаза ЕсоКЧ наиболее хорошо изучена и чаще всего используется в белковой инженерии [319]. [c.442]

Смотреть страницы где упоминается термин Эндонуклеазы сайт-специфические: [c.104] [c.288] [c.104] [c.202] [c.79] [c.61] [c.138] [c.222] [c.256] [c.179] [c.179] [c.61] [c.451] [c.886] [c.125] [c.142] [c.88] [c.89] [c.123] [c.99] [c.88] [c.89] [c.419] [c.48] [c.94] [c.151] [c.140] [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология