Фаги как векторы для клонирования

Векторы для клонирования. Используют для увеличения количества (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в такой вектор, посредством репликации. В этом качестве наиболее часто используются бактериальные плазмиды и фаги. Для клонирования больших фрагментов генома используют векторы — искусственные бактериальные и дрожжевые хромосомы (ВАС и YA ). [c.36]

Геном бактериофага X был превращен генными инженерами в наиболее удобный вектор для клонирования крупных фрагментов чужеродной ДНК. В геноме фага X есть два участка, не содержащие генов, необходимых для литического развития и производства потомства. Эти участки включают, соответственно, 22000 нуклеотидных пар в середине карты и 3000 между генами Р и Q (см. рис. 7.7). Таким образом, около [c.280]

Векторы на основе бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК. Лучшие векторы такого типа разработаны на основе фага М13. В зрелую фаговую частицу входит одноцепочечная ДНК длиной 6500 нуклеотидов. После проникновения в клетку одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (РФ), которую выделяют из клеток и используют как вектор для клонирования. В инфицированной клетке накапливается 100—200 копий РФ ДНК. После этого синтез становится асимметричным и синтезируется лишь одна нить ДНК, которая входит в состав зрелого фага. Фаг М13 не убивает клетку, но лишь замедляет ее деление. Частицы зрелого фага непрерывно выделяются в среду, и их титр в культуральной жидкости может достигать 10 в 1 мл. [c.152]

Секвенирование ДНК с помощью вектора на основе фага М13 Для определения нуклеотидной последовательности клонированных ДНК используются разные подходы. Один из первых основывался на [c.91]

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Выбор РНК-полимеразы может быть продиктован несколькими соображениями — в том числе выбором вектора. Однако следует иметь в виду следующее. РНК-полимеразы фагов Т7 и ТЗ обычно производят путем экспрессии клонированных генов. Поэтому они значительно дешевле РНК-полимеразы SP6 и их можно использовать в больших количествах. Вместе с тем РНК-полимеразы фагов Т7 и 73 обладают перекрестной специфичностью, особенно при низких концентрациях солей, при которых полимераза фага Т7 способна инициировать транскрипцию на ТЗ-промоторе и наоборот. Вследствие этого векторы, содержащие оба промотора, могут обеспечивать синтез само-комплементарной РНК- Это может и не мешать например, для [c.18]

Клонирование при использовании в качестве векторов бактериофага А осуществляется следующим образом к суспензии бактерий, обработанных СаСЬ., добавляется ДНК фага и осуществляется посев на чашку Петри с питательным агаром так, чтобы на [c.435]

Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг К (рис. 2.20). Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарущается. Схематически эта процедура представлена на рис. 25.7. [c.222]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Рис. 19.2. Фаговые векторы могут быть использованы для клонирования чужеродной ДНК, встраиваемой в область генома фага, не содержащую жизненно необходимые гены.

ВЕКТОР ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ. Любая плазмида или фаг, в которые может быть встроена чужеродная ДНК с целью клонирования. [c.520]

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного мутагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага M13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК M13 клетки Е. соИ. Часть образующихся в клетках фаговьгх частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую [c.175]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

Понятие клон определяе гея как большая популяция идентичных молекул, бактерий или клеток— потомков одного предка. Клонирование позволяет получать большое количество идентичных молекул ДНК, которые можно охарактеризовать и использовать в каких-то целях. Метод клонирования основан на том факте, что химерные или гибридные молекулы ДНК могут быть сконструированы в составе векторов для клонирования, к которым относятся бактериальные плазмиды, фаги или космиды, способные к репликации в хозяйских клетках под контролем своих собственных регуляторных элементов. Таким путем добиваются амплификации химерной ДНК. Общая схема процесса клонирования представлена на рис. 36.3. [c.40]

Как уже упоминалось, чаще всего в качестве матрицы для анализа используются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах. Для унификации анализа последовательности любых фрагментов, клонированных в составе данного фага-вектора, можно использовать одну и ту же затравку. Для этого затравка должна быть комплементврна ие клонированному фрагменту, а (- -)-цепи фага вектора в том ее месте, которое граничит с З -концом клонированной вставки (рис. 185). В качестве затравок чаще всего используются синтетические олиго- и дезоксирибонуклеотиды. Для исключения деградации затравки с 5 -конца в качестве ДНК-полимеразы применяется обычно фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. oli. [c.328]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Космидные векторы — плазмиды, несущие os-последователь-ности, распознаваемые компонентами системы упаковки фага X [1], представляют собой удобный инструмент для клонирования и анализа больших фрагментов геномов, картирования хромосом и клонирования генов, размер которых превышает 20 т. п. н. Хотя в настоящее время разработаны приемы, позволяющие конструировать космидные клоны и оперировать с космидными библиотеками, все же неизбел но возникают трудности при получении и анализе больших библиотек, необходимых для клонирования генома млекопитающих в частности, вызывает затруднение введение специфических модификаций во вставки в тех случаях, когда их нельзя прямо увязать с характеристиками рестрикционной карты. Эти трудности могут быть весьма существенными. Во многих случаях для их преодоления используются методы генетики бактерий, позволяющие упростить илп облегчить решение этих задач. [c.74]

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78]

На основе бактериофага Я. были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 т. н. п. весьма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на основе фага А. учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага ( 19 т. н. п.) не нужна для репликации фага в Е. соИ. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые правое и левое плечо фага), необходимые для репликации, остаются неизменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и используют в качестве векторов для клонирования, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером около 9— 21 т. н. п. Размножаются в бактери-40 [c.40]

Е. соИ. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках Е. oli стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точ-ковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага М13, использовании мутантных штаммов Е. соН типа dut ung и в переносе мутантного гена из Ml 3-вектора в экспрессирующий вектор. [c.163]

Плазмиды и фаги обеспечивают перенос чужеродной ДНК в качестве инертной части генома, поэтому их называют еще клонирующими векторами В биологической технологии выгодны мультикопийные плазмиды (10-20 на клетку) Если же плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации, когда прекращается размножение бактерий, то они (плазмиды) накапливаются числом до 1000 на клетку — в результате больше образуется целевого продукта В отличие от хромосомы репликация плазмиды в пермиссивной клетке может происходить при остановке синтеза белка Вот почему, например, при добавлении левоми-цетина к культуральной жидкости сопровождается заметным возрастанием числа копий плазмиды (увеличение степени клонирования) [c.201]

В качестве таких векторов для клонирования (или клонирующих векторов) любых фрагментов чужеродной ДНК используются фаг X и множество различных плазмид. Вектор с клонируемым фрагментом ДНК может проникнуть в клетку Е. соН после того, как клетка обработана ионами Са Такая процедура позволяет конструировать штаммы бактерий, несущих определенные фрагменты чужеродной ДНК (клоны), и размно- [c.276]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

Векторы на основе фага Я особенно удобны для создания клонотек, но мало приспособлены для тонких манипуляций с клонированными фрагментами ДНК. Обычно для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК после их обнаружения в клонотеке переклонируют в плазмидные векторы. [c.149]

На рис. 26 приведен один из векторов на основе фага М13. Следует отметить, что для репликации этого фага используется весь его геном, за исключением небольшой области (507 и.о.), названной межгенной последовательностью. Именно только ь эту область можно встроить чужеродную ДНК. Обычко вставляют полилинкер (рис. 27), что делает вектор более универсальным, так как появляется возможность применять для клонирования разные рестриктазы. В приведенном на рисунке векторе и во многих других в межгенной области находится N-концевой участок гена -галактозидазы со встроенным в него полилинкером. [c.152]

После знакомства с различным типом векторов приведем пример современного унивёрсального вектора для клонирования чужеродной ДНК (рис. 27). Он содержит сильные промоторы фагов ТЗ и Т7. Эти промоторы были синтезированы химически с наименьшей гомологией между ними для предотвращения образования шпилечных структур. Вставка любого фрагмента ДНК в полилинкер эффективно транскрибируется под контролем промотора фага Т7 или ТЗ (в зависимости от ориентации клонированного фрагмента). [c.153]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология