Повторный скрининг положительных колоний

Е. Повторный скрининг положительных колоний [c.31]

После гибридизации гибридизационный раствор сливают и хранят при —20 °С. Его используют для повторного скрининга положительных колоний. Фильтр промывают в коробке двухлитровыми порциями подогретого буфера. Условия промывки можно варьировать. В большинстве случаев мы проводим промывку при 65°С два раза в растворе ЗХ55С, 0,1%-ного ДСН и два раза в растворе 1х55С, 0,1%-ного ДСН. Продолжительность каждой промывки составляет от 20 до 30 мин. Ее осуществляют при постоянном перемешивании на ротационной качалке, снабженной водяной баней. Радиоактивность фильтров после промывки определяют с помощью счетчика Гейгера. По завершении последней промывки она должна быть близка к фону. [c.29]

Колонии, дающие положительную реакцию, затем нужно отобрать и провести повторный скрининг не менее трех раз для того, чтобы однозначно идентифицировать отдельные колонии. Не пытайтесь отобрать индивидуальную колонию уже в первом цикле отбора. Фильтры сморщиваются при —70 °С, что очень затрудняет точный отбор колоний. Отберите нужную зону, рассейте клетки и повторно скринируйте их. Очень легко ошибиться при отборе, поэтому не исключено, что операцию придется проверить. При использовании высококопийиых векторов на основе фага К можно экспонировать фильтры при комнатной температуре с тем, чтобы избежать их сморщивания. [c.55]

Снятые с фильтра и ресуспендированные бактерии разводят и вновь высевают для повторного скрининга. Последний проводят на нитроцеллюлозных фильтрах (Miilipore, номер по каталогу 13750) для получения одиночных положительных колоний с помощью гибридизационного зонда. Фильтры Miilipore помещают в чашки Петри со средой L-амп (Fal on, № 1058, диаметр 15 см) число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге. [c.31]

Из каждой клеточной суспензии делают разведения 10 , 10 и 10" на среде L-амп (по 1 мл каждого). По 200 мкл каждого разведения наносят на /з площади фильтра (Grosveld et al., 1981), начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Miilipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий (обычно около 6 ч при 37 °С) клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 °С и используют для последующего отбора положительных колоний. [c.31]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология