Векторы иа основе фага

Векторы на основе бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК. Лучшие векторы такого типа разработаны на основе фага М13. В зрелую фаговую частицу входит одноцепочечная ДНК длиной 6500 нуклеотидов. После проникновения в клетку одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (РФ), которую выделяют из клеток и используют как вектор для клонирования. В инфицированной клетке накапливается 100—200 копий РФ ДНК. После этого синтез становится асимметричным и синтезируется лишь одна нить ДНК, которая входит в состав зрелого фага. Фаг М13 не убивает клетку, но лишь замедляет ее деление. Частицы зрелого фага непрерывно выделяются в среду, и их титр в культуральной жидкости может достигать 10 в 1 мл. [c.152]

Секвенирование ДНК с помощью вектора на основе фага М13 Для определения нуклеотидной последовательности клонированных ДНК используются разные подходы. Один из первых основывался на [c.91]

Емкость векторов, образуемых на основе фага X [c.160]

Векторная система на основе фага Р1, использующаяся для введения в клетки Е.соИ вектора с крупной вставкой (100-300 т.п.н.) с помощью электропорации. [c.550]

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Известны также фаговые векторы на основе фага Р22 — для [c.111]

К моменту появления методологии генетической инженерии колифаг Я по сравнению с другими вирусами бактерий был наиболее полно изучен генетически и молекулярно-биологически. Это и обусловило то, что наряду с плазмидными векторами уже в 1974 г. появилась серия клонирующих векторов на основе фага Я. [c.97]

I. Карты фага Я и векторов, образуемых на основе фага I [c.161]

Ранее были описаны некоторые из векторов, образованных на основе фага Я, которые были использованы для клонирования чужеродной ДНК и оказались очень удобными. На основе фага К сконструировано много векторов. Однако большинство из них либо не было использовано для клонирования чужеродной ДНК, либо было сконструировано не самым оптимальным образом. [c.161]

Рис. 1.5. Получение меченого одноцепочечного фрагмента ДНК с помощью вектора на основе фага М13 и специального олигонуклеотида

Фаговые векторы актиномицетов сконструированы главным образом на основе фага 0С31, который в течение долгих лет был предметом генетических и молекулярно-биоло- [c.168]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

На основе бактериофага Я. были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 т. н. п. весьма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на основе фага А. учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага ( 19 т. н. п.) не нужна для репликации фага в Е. соИ. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые правое и левое плечо фага), необходимые для репликации, остаются неизменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и используют в качестве векторов для клонирования, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером около 9— 21 т. н. п. Размножаются в бактери-40 [c.40]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием векторов на основе фага М13 эффективный универсальный метод внесения точковых мутапий в любой фрагмент ДНК [c.165]

Комбинаторная библиотека ( omhinatorial library) Библиотека, полученная встраиванием в вектор на основе фага I. кДНК легкой и тяжелой цепей различных антител - по одной комбинации в вектор. [c.550]

Космида ( osmid) Вектор, объединяющий свойства плазмидного вектора и вектора на основе фага X. Имеет os-сайты. [c.551]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на основе векторных фагов Я (см. табл. 2.1). Однако последние все же предпочтительнее в тех случаях, когда не требуются фрагменты размером более 20 тпн. Это связано с некоторыми техническими сложностями, возникающими при конструирован библиотек генов на основе космид. Так, оказалось, что при этом происходит лигирование векторов друг с другом (см. рис. 2.20), что дает высокий фон клонов, не содержащих вставок чужеродной ДНК. Кроме того, скрининг большого числа колоний бактерий проводить сложнее, чем фаговых бляшек. Клонированные крупные фрагменты в составе ДНК фага более стабильны, чем в космидах, поскольку репликон фага адаптирован к поддержанию молекул большого размера. Важно отметить, что для предотвращения встройки в космидный вектор нескольких несоседних на геноме фрагментов необходимо проводить фракционирование клонируемой ДНК или дефосфорилирова-ние, как и в случае получения библиотек генов на основе фага Я. [c.105]

Колонии, дающие положительную реакцию, затем нужно отобрать и провести повторный скрининг не менее трех раз для того, чтобы однозначно идентифицировать отдельные колонии. Не пытайтесь отобрать индивидуальную колонию уже в первом цикле отбора. Фильтры сморщиваются при —70 °С, что очень затрудняет точный отбор колоний. Отберите нужную зону, рассейте клетки и повторно скринируйте их. Очень легко ошибиться при отборе, поэтому не исключено, что операцию придется проверить. При использовании высококопийиых векторов на основе фага К можно экспонировать фильтры при комнатной температуре с тем, чтобы избежать их сморщивания. [c.55]

Векторы на основе бактериофага Я. Бактериофаг Я. — это вирус, размножающийся на бактериях Е. соИ. За последние 3U лет он стал излюбленным и наиболее изученным объектом генетиков и молекулярных биологов. Геном фага Я. представлен двуцепочечной ДНК размером в 48,5 т.п.о., которая упакована в головку фага в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами длинои в 12 п.о. (липкие концы). После проникновения в клетку липкие концы объединяются и ДНК замыкается в кольцо. Кольцевая ДНК является репликативной формой. Возможность создания векторов на основе фага Я связана с тем его свойством, что гены центральной части (от I до N) несущественны для литического развития. Уже более 20 лет известны способы замещения центральной части фага сегментами бактериальной хромосомы путем определенных генетических манипуляций in vivo. Созданные таким образом специализированные трансдуцирующие фаги хорошо изучены. Идея провести манипуляцию замены центральной части ДНК фага Я in vitro на чужеродные фрагменты послужила поэтому логическим продолжением опытов in vivo. [c.147]

Рис. 2. Н Соотношение размеров молекул вектора и вставки а.1я векторов, соданны.х на основе фага ).

Векторы на основе фага Я особенно удобны для создания клонотек, но мало приспособлены для тонких манипуляций с клонированными фрагментами ДНК. Обычно для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК после их обнаружения в клонотеке переклонируют в плазмидные векторы. [c.149]

По клонирующей емкости фазмиды сравнимы с векторами на основе фага К и значительно уступают космидам (см. рис. 23). Однако возможность смены фаз, т. е. экспериментально регулируемая возможность развития по фаговому или плазмидиому пути, дает ряд преимуществ фазмидным векторам. Преимущества эти осознаны и использованы лишь недавно, хотя гибриды между [c.150]

На рис. 26 приведен один из векторов на основе фага М13. Следует отметить, что для репликации этого фага используется весь его геном, за исключением небольшой области (507 и.о.), названной межгенной последовательностью. Именно только ь эту область можно встроить чужеродную ДНК. Обычко вставляют полилинкер (рис. 27), что делает вектор более универсальным, так как появляется возможность применять для клонирования разные рестриктазы. В приведенном на рисунке векторе и во многих других в межгенной области находится N-концевой участок гена -галактозидазы со встроенным в него полилинкером. [c.152]

Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют в однонитевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить и использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- [c.285]

До разработки более совершенных векторных фагов самыми популярными векторами замещения на основе фага Я, предназначенными для клонирования соКГфрагментов, являлись штаммы Яgt-Я , Яgt-ЯB (см. рис. 2.17, а, б), в которые можно встраивать соК1-фрагменты ДНК размером до 15,1 тпн. Популярность этих векторов обусловлена тем, что их векторная часть Яgt-0 (правый и левый концы ДНК фага без внутреннего соКЬфрагмента) не образует жизнеспособного фагового потомства, так как молекула ДНК Яgt-0 слишком короткая. Гибридные же ДНК дают жизнеспособное фаговое потомство. [c.101]

Кроме векторов — производных фага М13 получен ряд векторов на основе фагов fd и fl. На рис. 2.32 приведена структура нескольких векторных вариантов фага fd, которые были сконструированы по стратегии, разработанной при получении фага М13тр1. В данном случае векторные фаги обусловливают устойчивость к антибиотикам, и поэтому инфицированные ими клетки способны расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком. При этом клоны клеток Е. oli, инфицированных (трансфицированных) гибридными фагами, легко выявляются на селективных средах. [c.117]

Удобные векторы бьши сконструированы на основе фага М13 (разд. 5.3), представителя группы так называемых Ff- (т.е. F-специфичных нитчатых) фагов. Эти фаги инфицируют только те клетки Е. соИ, которые несут половой фактор, называемый F-фак-тором (см. введение к ч. II). Поэтому хозяином для фага М13 должен быть штамм F"", каким является штамм 71-18. У Е. соИ 71-18 /u -оперон делетирован ijS la -pro]) из геномной ДНК, но он содержится в F-плазмиде (F ас). Для облегчения работы с этим штаммом F /u -плазмиду маркируют делецией (AM 15), соответствующей N-концу р-галактоз и да-зы. Голубые бляшки, указывающие на присутствие активной -галактозидазы, обнаруживаются на агаре с Xgal только в том случае, если вектор М13 содержит область (la Za) /o -оперона, отсутствующую в F la . Каждый из двух геномов (F la [ДМ 15] и М13 la Za) детерминирует свою часть молекулы -галактозидазы, и в результате их взаимодействия внутри клетки образуется активная -галактозидаза. [c.229]

Типичный вектор, сконструированный на основе фага X. С помощью эндонуклеазы Есо RI из генома фага X вырезают необязательную центральную часть. Боковые участки отжигают вместе с фрагментом, имеющим Есо RI-липкие концы, и лигируют. В результате образуются конкате-мерные структуры, состоящие из боковых участков генома фага X и вставки, которые соединены друг с другом через липкие концы и os-сайты. [c.240]

Типичный вектор, сконструированный на основе фага М13. В некодирующую область фагового генома встроена часть /ас-оперона со//. Затем в ген 1ас1 встроен сегмент длиной 42 п.н., содержащий несколько сайтов для эндонуклеаз рестрикции (полилинкер, или мульти-клонирующий сайт). [c.245]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология