Гибридизационные зонды

Гибридизационные зонды для геномной дактилоскопии [c.192]

С помощью обратной транскриптазы можно синтезировать копию любой части мРИК, выбрав для этого подходящий праймер. Эта возможность облегчает анализ строения какого-либо специфического участка гена. Но можно получить и набор генных фрагментов, если использовать в качестве праймеров произвольные олигонуклеотиды, получаемые, например, в результате гидролиза ДНК тимуса теленка панкреатической ДНКазой. Их разнообразие столь велико, что среди них имеются комплементарные последовательности к любому из участков мРИК (или ДНК). Добавление в реакционную смесь суммарной фракции таких праймеров дает возможность получить в наборе J HK копии всех участков анализируемого гена. Они полезны для использования их в качестве гибридизационных зондов, применяемых для поиска определенных клонов в банках генов (см. гл. 9). [c.182]

На основании каждой из трех приведенных моделей могут быть сделаны различные предсказания относительно размеров рестрикционных фрагментов (тестируемых с помощью гибридизационных зондов на последовательности типа У2 и С), образующихся при обработке препаратов эмбриональной ДНК и ДНК из клеток плазмы. Согласно модели (а), гены 1 2 и С должны в эмбриональной ДНК находиться на разных рестрикционных фрагментах. В препаратах ДНК из клеток плазмы будут обнаруживаться -содержащие фрагменты, аналогичные фрагментам эмбриональной ДНК, а также новые фрагменты, содержащие связанные между собой гены 1 2 и С. В отличие от этой мо- [c.290]

Тандемные повторы М13 локализуются в положениях 1700— 1900 и 2300—2500 фагового генома. Можно использовать эти данные и свойства фагового вектора для синтеза гибридизационного зонда с высокой удельной активностью (табл. 3). После [c.198]

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

Векторы, использующие репликаторы нитевидных фагов, применяют для получ Ения однонитевых фрагментов ДНК с целью их секвенирования или приготовления гибридизационных зондов. [c.238]

Дизайн гибридизационных зондов. Гибридизационные зонды должны отвечать определенным требованиям [c.472]

Первый шаг на этом пути состоит в вьщелении и очистке 2,5-DKG-peдyктaзы oryneba terium sp. и определении последовательности ее первых 40 N-концевых аминокислот. Исходя из этих данных были синтезированы два 43-нуклеотидных гибридизационных зонда, соответствовавших разным частям белковой молекулы. Поскольку 71% нуклеотидов ДНК oryneba terium sp. представляют собой либо G, либо С, зонды синтезировали таким образом, чтобы в третьем положении кодонов по возможности находились именно они. Это позволяло минимизировать число неспаренных оснований между зондами и искомой ДНК. [c.250]

Для вьщеления других генов, участвующих в фиксации азота, применяли два подхода. Во-первых, использовали банк клонов К. pneumoniae для комплементации независимо возникающих Nif -MyTaHTOB, увеличивая тем самым вероятность того, что в каждом случае будет выделен другой иг/-ген. Во-вторых, вьщеленные и//-гены использовали в качестве гибридизационных зондов для скрининга банка клонов хромосомной ДНК К. pneumoniae, несущих большие вставки (от 7 до 10 т. п. н.), исходя из того, что у прокариот гены одного пути биосинтеза обычно образуют кластеры. [c.310]

Предложите стратегию идентификации всех генов Azotoba ter vinelandii, участвующих в связывании азота, имея в виду, что у вас нет nif-тшов других микроорганизмов, которые можно было бы использовать в качестве гибридизационных зондов. [c.330]

Проблема патентования молекул ДНК весьма противоречива. Ведомство по патентам и товарным знакам США (РТО) отказало в выдаче патентов на частично секвенированные кДНК, поскольку в заявках отсутствовали конкретные данные о их практической пользе отказано было и в выдаче патентов на гены, идентифицированные с помощью гибридизационных зондов, которые были синтезированы исходя из опубликованных данных по аминокислотной последовательности. Позже решение РТО было отменено в суде на основании того, что вырожденность генетического кода не позволяет однозначно определить нуклеотидную последовательность кДНК исходя из данных об известной аминокислотной последовательности соответствующего белка, а следовательно, условие неочевидности, необходимое для патентования такого рода изобретений, выполняется. [c.541]

Обсудите решения РТО и Аппеляционного суда федерального округа США по поводу патентоспособности генов, идентифицированных с помощью гибридизационных зондов, которые были сконструированы на основе опубликованных данных об аминокислотных последовательностях соответствующих белков. [c.542]

В настоящее время все более широкое применение находит использование РНК в качестве специфических гибридизационных зондов, а также в качестве субстратов и реагентов при анализе широкого круга биологических процессов. Чрезвычайно высокая специфичность кодируемых фагами полимераз и небольшие размеры их промоторов (во многих случаях это всего 15 пар оснований) открывают путь новым методическим подходам, которые не следует игнорировать. Возможность использования готовых коммерческих наборов или отдельных компонентов для синтеза РНК in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ значительно облегчает решение экспериментальных задач, в которых требуется синтезировать меченые зонды, а некоторые уникальные функции и специфические свойства РНК в ряде случаев делают описанные системы просто незаменимыми. [c.38]

Снятые с фильтра и ресуспендированные бактерии разводят и вновь высевают для повторного скрининга. Последний проводят на нитроцеллюлозных фильтрах (Miilipore, номер по каталогу 13750) для получения одиночных положительных колоний с помощью гибридизационного зонда. Фильтры Miilipore помещают в чашки Петри со средой L-амп (Fal on, № 1058, диаметр 15 см) число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге. [c.31]

Гибридизационные зонды могут использоваться также для обнаружения генетических изменений, ведущих к потере рестрикционного сайта (см. гл. 38). Например, при серповидноклеточной анемии наблюдается точечная мутация в кодоне GAG (Glu), в результате которой появляется кодон GTG (Val) такую мутацию в р-глобиновом гене можно обнаружить, взяв для анализа всего 10 мл амниотической жидкости и используя эндонуклеазу рестрикции Mst И или Sau I (Orkin et al., 1982). [c.74]

Отсутствие заметной гомологии между ДНК многих микоплазм было отмечено еще в работах конца 60-х годов [58—60]. По более точным количественным данным перекрестной гибридизации ДНК разных микоплазм в растворах было установлено, что гомология по ДНК у большинства видов не превышает 2 %, и только у нескольких пар сравниваемых микоплазм гомология составила от 4 до 21 % [61—63]. В нашей работе [64] по перекрестной блот-гибридизации ДНК ряда микоплазм показано, что при низком уровне гомологии ДНК исследованных видов эта гомология касается отдельных протя- женных фрагментов генома, а не коротких участков, распределенных по всей его длине. Более того, у некоторых микоплазм единственными гомологичными участками ДНК оказываются рибосомные гены., На основании этих результатов мы начали использовать в качестве гибридизационных зондов для обнаружения и идентификации микоплазм тотальные препараты ДНК, полученные из микоплазм, выращенных на специальных средах. Такие зонды оказались высокоэффективными и достаточно специфичными, но их нельзя рекомендовать к широкому применению, так как получение чистых культур микоплазм и их выращивание в препаративных количествах связаны со значительными техническими трудностями. В связи с этим мы предприняли клонирование случайных рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм в бактериальной плазмиде pBR322 и проверку рекомбинантных Ь лазмиЯ на специфичность в опытах по блот- и дот-гибридизации с ДНК различных микоплазм и ДНК клеток эукариот. Был составлен комплект плазмид-зондов, содержащих фрагменты ДНК, видоспецифичные для каждой из взятых микоплазм. В дальнейшем этот комплект должен быть расширен. [c.118]

Рис. 9-23. Строение транскрипционной единицы рибосомной РНК (4) и чувствительность к ультра-фнолету транскрипционных единиц 58-РНК и других рибосомных РНК (i) задача 9-28). А. Указано расположение гибридизационных зондов относительно промотора (левый конец стрелки) в транскрипционной единице. Б. Транскрипция в зависимости от дозы облучения ультрафиолетом, выявленная при дот-гибридизации (слева) и представленная в виде графика (справа).

Справочник химика 21

Химия и химическая технология