Повторный скрининг

Е. Повторный скрининг положительных колоний [c.31]

Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотидные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, т.е. гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой. [c.164]

Помните, что необходимо отбирать для анализа супернатанты из лунок с хорошим ростом гибридом такая проба будет содержать оптимальное количество антител. Очень простой радиоиммунологический метод может быть использован для тестирования адекватных уровней антител в супернатантах и для повседневного контроля за образованием антител в лунках [13]. Особую ценность данный метод приобретает в том случае, если наблюдается рост в большом числе лунок, а скрининг супернатантов еще не дает положительных результатов. Обнаружение с помощью антиглобулиновых реагентов значительных титров антител означает, что чувствительность первичного скрининг-теста недостаточна и его необходимо усовершенствовать. Если выявляют мышиные иммуноглобулины в незначительной концентрации, то необходимо подождать, пока гибридомные клетки вырастут, а затем взять повторные пробы для скрининга. Можно сконцентрировать анализируемые супернатанты, хотя обычно в этом нет необходимости. [c.135]

Приблизительно через 2 нед клоны в лунках, содержащих размножающиеся клетки (клоны по 10 —10 Т-клеток), становятся хорошо заметными под микроскопом. Эффективность клонирования в различных опытах варьирует от 10 до 80%-Клетки из каждой положительной лунки переносят индивиду--ально в лунки 24-луночных панелей вместе с 5-10 облученных МПК, где они размножаются в среде GM до тех пор, лока не образуется количество клеток, достаточное для скрининга. Подобным образом клетки могут быть повторно клонированы при разведении 0,2 клетки на лунку. [c.274]

Колонии, дающие положительную реакцию, затем нужно отобрать и провести повторный скрининг не менее трех раз для того, чтобы однозначно идентифицировать отдельные колонии. Не пытайтесь отобрать индивидуальную колонию уже в первом цикле отбора. Фильтры сморщиваются при —70 °С, что очень затрудняет точный отбор колоний. Отберите нужную зону, рассейте клетки и повторно скринируйте их. Очень легко ошибиться при отборе, поэтому не исключено, что операцию придется проверить. При использовании высококопийиых векторов на основе фага К можно экспонировать фильтры при комнатной температуре с тем, чтобы избежать их сморщивания. [c.55]

Основное достоинство генетического подхода — быстрота и эффективность метода достаточно большое число экспериментов можно проводить параллельно. Поэтому не возникает нужды в повторном скрининге, что делает этот метод особенно удобным там, где требуется повторное выделение многих космид (например, при прогулке по хромосоме ). Другое преимущество генетического метода — очень высокая чувствительность гомологичной рекомбинации к ошибочному спариванию последовательностей [25, 26], Данное обстоятельство может быть особенно удобным, например, при выделении космид, содержащих конкретные копии тех или иных семейств генов, или в экспериментах по прогулке по хромосоме . Такие эксперименты упрощаются при работе с некоторыми из наших новых векторов (Эрих и др., в печати), содержащих ЫоИ-сашы, фланкирующие инсерционный сайт, что позволяет провести быстрое и избирательное клонирование концевых фрагментов вставки в производных риС18 или рЕМВЬ18, содержащих 7Уо/1-сайты в полилинкере. [c.84]

Пропорционально увеличьте объем реакционной смеси для упаковки. Путем контрольных высевов определите максимальное количество упакованного материала, которым можно инфицировать бактерии без ущерба для эффективности процесса. В дальнейшем выращивайте рекомбинантные бактериофаги для библиотеки на 150-мм чашках, исходя из полученного значения плотности (или 40 000 фаговых частиц на чашку) и используя в качестве бактерии-хозяина штамм МС1061. Библиотеку затем можно скринировать или амплифицировать стандартным способом для последующего повторного скрининга. [c.110]

После гибридизации гибридизационный раствор сливают и хранят при —20 °С. Его используют для повторного скрининга положительных колоний. Фильтр промывают в коробке двухлитровыми порциями подогретого буфера. Условия промывки можно варьировать. В большинстве случаев мы проводим промывку при 65°С два раза в растворе ЗХ55С, 0,1%-ного ДСН и два раза в растворе 1х55С, 0,1%-ного ДСН. Продолжительность каждой промывки составляет от 20 до 30 мин. Ее осуществляют при постоянном перемешивании на ротационной качалке, снабженной водяной баней. Радиоактивность фильтров после промывки определяют с помощью счетчика Гейгера. По завершении последней промывки она должна быть близка к фону. [c.29]

Снятые с фильтра и ресуспендированные бактерии разводят и вновь высевают для повторного скрининга. Последний проводят на нитроцеллюлозных фильтрах (Miilipore, номер по каталогу 13750) для получения одиночных положительных колоний с помощью гибридизационного зонда. Фильтры Miilipore помещают в чашки Петри со средой L-амп (Fal on, № 1058, диаметр 15 см) число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге. [c.31]

Из каждой клеточной суспензии делают разведения 10 , 10 и 10" на среде L-амп (по 1 мл каждого). По 200 мкл каждого разведения наносят на /з площади фильтра (Grosveld et al., 1981), начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Miilipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий (обычно около 6 ч при 37 °С) клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 °С и используют для последующего отбора положительных колоний. [c.31]

Исходный фильтр можно заморозить для повторного использования (по методу Ханаана и Меселсона [18]) или хранить при 4 °С до месяца. Реплику нужно подрастить 3—5 ч при 37 °С. Должны получиться колонии диаметром около 1 мм или меньше. Они могут быть использованы для скрининга. [c.54]

Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отнощению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК, присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0,lXSS , 0,1%-ноге ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов). [c.35]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология