Положительные колонии

В герметично закрывающиеся полиэтиленовые мешочки и замораживают при —70 °С. Этот набор используют для отсева положительных колоний, выявляемых с помощью радиоактивных зондов. [c.27]

Один и тот же набор фильтров можно использовать для гибридизации многократно при скрининге библиотеки различными зондами. Удалять меченые зонды от предшествующих циклов гибридизации нет необходимости. Фильтры просто проводят через еще одну реакцию гибридизации, промывают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Новые положительные колонии выявляют путем сопоставления новых пленок с теми, которые были получены в предшествующих гибридизациях. [c.29]

Е. Повторный скрининг положительных колоний [c.31]

Фильтры инкубируют в большой стеклянной чашке Петри, покрытой стеклянной пластинкой, как описано ранее (разд. IV, А). Для гибридизации используют супернатант от исходного скрининга (разд. IV, Б), который прогревают 10— 15 мин при 70 °С для денатурации ДНК и охлаждают в смеси воды и льда. После гибридизации фильтры отмывают, экспонируют и отбирают на них одиночную, находящуюся на достаточном расстоянии от других положительную колонию (разд. IV, В—Д). Положительный клон высевают штрихом в свежую чашку с агаром L-амп и подготавливают ночную культуру для выделения ДНК в среде L-амп. [c.31]

В то время как в области катода всегда закономерным образом чередуются друг за другом ряд светящихся и затемненных пространств поверхность катода — темное пространство Астона — световая оболочка — темное пространство Хиторфа — свет, вызванный тлеющим разрядом,— темное пространство Фарадея — плазма), явления в ионизированной массе газа, которая обычно заполняет большую часть разрядной трубки и называется плазмой (или положительной колонной), подчиняются в значительной степени внешним условиям. Слоистость, часто наблюдаемая в плазме, зависит не только от давления, но и от вида и чистоты присутствующего газа иногда свечение в плазме совсем не появляется, так же как, например, в шарообразном разрядном пространстве. [c.538]

Клетки нз всех лунок, оказавшиеся при скрининге положительными, надо субкультивпровать. Для этого переносите содержимое этих лунок в 24-луночиый планшет и добавьте в каждую лунку по 0,5 мл свежей среды. Клетки из такого планшета могут служить источником для клонирования клеток данной гибридомной линии кроме того, их можно рассеять на чашке Петри диаметром 90 мм и заморозить. Если слияние оказалось очень удачным, можно сразу не справиться с размножением и клонированием слишком большого количества клеток. В такой ситуации лучше выбрать только пять или десять положительных колоний для немедленного их размножения, а остальные заморозить до проведения дальнейших исследований. После размножения колоний в планшете с 24 лунками скрининг следует повторить и, кроме того, провести и более жесткий скрининг другим способом. Если в результате слияния во многих лунках наблюдается рост клеток и обнаруживаются антитела к -галактозидазе, но не обнаруживается антител к белковому продукту встроенного фрагмента, тогда единственно, что остается делать, — это повторить слияние в тех же условиях, в которых проводилось предыдущее. Если, однако, в результате слияния вообще образуется небольшое число клонов гибридных клеток, тогда стоит попробовать внести изменения в методику слияния. К ним относятся использование так называемого питающего слоя для роста клеток и внесение в среду добавок. [c.192]

После гибридизации гибридизационный раствор сливают и хранят при —20 °С. Его используют для повторного скрининга положительных колоний. Фильтр промывают в коробке двухлитровыми порциями подогретого буфера. Условия промывки можно варьировать. В большинстве случаев мы проводим промывку при 65°С два раза в растворе ЗХ55С, 0,1%-ного ДСН и два раза в растворе 1х55С, 0,1%-ного ДСН. Продолжительность каждой промывки составляет от 20 до 30 мин. Ее осуществляют при постоянном перемешивании на ротационной качалке, снабженной водяной баней. Радиоактивность фильтров после промывки определяют с помощью счетчика Гейгера. По завершении последней промывки она должна быть близка к фону. [c.29]

Перед проявлением кассетам дают возможность прогреться до комнатной температуры, удаляют усиливающий экран и пленку и закрывают кассету, чтобы избежать какого бы то ни было движения фильтров на бумаге Whatman 3 ММ. После идентификации положительных колоний (см. ниже) фильтры хранят при —70 °С в картонной коробке, а для дальнейшей работы используют проявленную пленку (разд. IV, Б). [c.30]

Для отсева положительных колоний из морозильника достают чашки со средой HMF-2 амп, содержащие фильтры с замороженными бактериями. Им дают возможность оттаять при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего фильтры вынимают и вносят в чашки со свежей средой L-амп. Если фильтры слишком влажные, их подсушивают в течение короткого времени на бумаге Whatman 3 ММ. Бактериям дают возможность восстановить свою жизнеспособность с помощью инкубации их в чашках при комнатной температуре в течение 2 ч. Пленку для радиоавтографии помещают на световой ящик и закрывают ее пленкой Saran, на которую кладут фильтр, содержащий живые колонии. Фильтр и пленку совмещают с помощью маркирующих отверстий. Область над положительным сигналом соскабливают стерильной зубочисткой и суспендируют бактерии в 500 мкл бульона L-амп. Фильтр кладут в чашку со средой HMF-2 амп и оставляют ее при комнатной температуре еще на [c.30]

Снятые с фильтра и ресуспендированные бактерии разводят и вновь высевают для повторного скрининга. Последний проводят на нитроцеллюлозных фильтрах (Miilipore, номер по каталогу 13750) для получения одиночных положительных колоний с помощью гибридизационного зонда. Фильтры Miilipore помещают в чашки Петри со средой L-амп (Fal on, № 1058, диаметр 15 см) число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге. [c.31]

Из каждой клеточной суспензии делают разведения 10 , 10 и 10" на среде L-амп (по 1 мл каждого). По 200 мкл каждого разведения наносят на /з площади фильтра (Grosveld et al., 1981), начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Miilipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий (обычно около 6 ч при 37 °С) клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 °С и используют для последующего отбора положительных колоний. [c.31]

Точность. Точность метода НВЧ определяется главным образом числом используемых пробирок, а не плотностью бактерий. Стандартная ошибка при отборе проб может быть очень малой лишь при использовании большого числа пробирок (много больше, чем 5). Точность же метода мембранной фильтрации зависит в первую очередь от числа положительных колоний >, подсчитанных на одной мембране. Таким образом, точность счета на мембранном фильтре можно увеличить, просто фильтруя больше воды, чтобы увеличить тем самым число положительных колоний. В табл. 10.1 представлены объемы исследуемых проб воды, позволяющие сравнить по точности методы НВЧ и мембранной фильтрации [220]. Из этой таблицы следует, что мембранная фильтрация имеет ббльшие преимущества при анализах вод с высоким содержанием БГКП, таких, как неочищенная вода или поверхностные воды. При анализе питьевой воды, где величина НВЧ не ожидается большой, метод мембранной фильтрации для тех объемов пробы, для которых он обычно применяется (100 мл пробы), не имеет особых преимуществ с точки зрения точности, хотя другие его положительные стороны, перечисленные в этом разделе, еще сохраняются. Если же фильтрации подвергаются большие объемы, то точность этого метода также возрастает. [c.271]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология