Скрининг библиотек на основе фага

Для скрининга библиотек на основе фага X можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридиза-ция, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами. [c.74]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на основе векторных фагов Я (см. табл. 2.1). Однако последние все же предпочтительнее в тех случаях, когда не требуются фрагменты размером более 20 тпн. Это связано с некоторыми техническими сложностями, возникающими при конструирован библиотек генов на основе космид. Так, оказалось, что при этом происходит лигирование векторов друг с другом (см. рис. 2.20), что дает высокий фон клонов, не содержащих вставок чужеродной ДНК. Кроме того, скрининг большого числа колоний бактерий проводить сложнее, чем фаговых бляшек. Клонированные крупные фрагменты в составе ДНК фага более стабильны, чем в космидах, поскольку репликон фага адаптирован к поддержанию молекул большого размера. Важно отметить, что для предотвращения встройки в космидный вектор нескольких несоседних на геноме фрагментов необходимо проводить фракционирование клонируемой ДНК или дефосфорилирова-ние, как и в случае получения библиотек генов на основе фага Я. [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология