Вектор космидные

Дж Коллинс и Б Хон в 1978 г впервые ввели в практику так называемый космидный вектор, или os-вектор, то есть комбинированную векторную систему "плазмида-ДНК фага лямбда" Данный вектор способен акцептировать до 40-50 тыс пн При этом совмещаются плазмидные репликаторы и os-сайты фага X в одном [c.197]

К сожалению, в результате ошибочного спаривания праймера заданной длины с более чем одним участком внутри вставки могут быть получены неоднозначные результаты. Чтобы избежать этого, используют праймеры длиной не менее 24 нуклеотидов и стараются строго соблюдать условия отжига. Именно таким образом были секвенированы фрагменты ДНК, клонированные в бактериофаге X (-20 т. п. н.) или в космидном векторе (-40 т. п. н.). [c.93]

Так были впервые идентифицированы гены образования клубеньков и разработана четкая и эффективная схема отбора. Сконструированный Лонгом и др. космидный вектор с широким кругом хозяев в дальнейшем неоднократно использовался в других работах. [c.319]

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

ВЫБОР И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОСМИДНЫХ ВЕКТОРОВ [c.40]

Основным критерием выбора именно космидного вектора должна быть необходимость клонирования очень больших фрагментов ДНК в противном случае всегда легче и быстрей сконструировать фаговую библиотеку. [c.41]

Выбор и использование космидных векторов 43 [c.43]

Выбор н использование космидных векторов 49 [c.49]

Таблица 2.2. Приготовление плеч космидного вектора

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

Космидные векторы — плазмиды, несущие os-последователь-ности, распознаваемые компонентами системы упаковки фага X [1], представляют собой удобный инструмент для клонирования и анализа больших фрагментов геномов, картирования хромосом и клонирования генов, размер которых превышает 20 т. п. н. Хотя в настоящее время разработаны приемы, позволяющие конструировать космидные клоны и оперировать с космидными библиотеками, все же неизбел но возникают трудности при получении и анализе больших библиотек, необходимых для клонирования генома млекопитающих в частности, вызывает затруднение введение специфических модификаций во вставки в тех случаях, когда их нельзя прямо увязать с характеристиками рестрикционной карты. Эти трудности могут быть весьма существенными. Во многих случаях для их преодоления используются методы генетики бактерий, позволяющие упростить илп облегчить решение этих задач. [c.74]

Первые космидные векторы разработали Коллинз и Хон [1] для решения технических проблем, связанных с введением больших фрагментов ДНК в Esheri hia oli. Большинство методик получения компетентных клеток Е. oli обеспечивает перепое молекул ДНК размером до 10—15 т.п. п., а попытки использовать ДНК большей длины приводят к резкому уменьшению эффективности трансформации. Решающее значение для спешного внедрения больших плазмид в бактериальные клет- [c.40]

Существует много различных космидных векторов (см. Маниатис и др. [3], Пауэле и др. [4]). Наиболее важное значение из их свойств имеют лекарственная устойчивость, характер реп-ликона и наличие подходящих сайтов рестрикции. Рассмотрим их по порядку. [c.41]

Некоторые космиды несут кроме прокариотических маркеров лекарственной устойчивости гены,, обеспечивающие селекцию эукариотических клеток. Наиболее удобные из них — это гены тимидинкиназы и устойчивости к антибиотику G418 [4] но в принципе можно использовать и некоторые другие. Наличие селектированного маркера, облегчающего введение ДНК в эукариотические клетки, может служить решающим критерием при выборе вектора. Описаны подходы, предполагающие спасение космидной ДНК в подобных экспериментах, что часто требует определенных комбинаций детерминант устойчивости [5]. [c.42]

Выбор ферментов, используемых для двойного расщепления космидного вектора при приготовлении плеч по методу Иш-Горовица и Берка [10], определяется характеристиками данной космиды. На рис. 2.1 приведена схема общего метода для любого космидного вектора. Методика, детально описанная в табл. 2.2, касается семейства космид Лориста [7, 8], где фермент X — это Sstl, фермент Y — BsffiH, а сайт клонирования Я1Пс1П1. [c.47]

Гибридизация проводится в 2,5— 3 мл овежего буфера на фильтр. Буфер того же состава, что и в п. 2, но дополнительно содержит 10 имп./мин на 1 мл соответствующей Р-меченной РНК- или ДНК-зонда. Для РНК-зонда к смеси добавляют 10 мМ ВПК и гибридизуют 17 ч при 50 °С. ДНК-гибридизацию проводят 2 дня лри 42 °С. На стадии предварительной гибридизации мы обычно вводили в качестве конкурирующей ДНК денатурированный космидный вектор в концентрации 0,5—1 мкг/мл. [c.55]

Существует много способов выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Приводимая нами методика проста и вполне воспроизводима, но ее почти всегда можно заменить на другую. Мы описываем процедуру наработки космид Лориста — производных фага Я. Для других космидных векторов при необходимости можно ввести небольшие модификации. [c.60]

Эффективность этой процедуры, однако, всегда разочаровывает— она гораздо ниже, чем можно предположить, работая с мини-препаратами. Вместе с тем 50 мл культуры дают по меньшей мере 200—300 мкг космиды. Выход нерекомбинантных космидных векторов — производных фага к также низкий мы редко получали более 200 мкг из 1 л. Это обусловлено механизмами контроля репликации этих производных фага X. [c.61]

В основе метода лежит использование двух векторов — одного космидного, а другого плазмидного, не имеющих областей взаимной гомологии и различающихся по маркерам лекарственной устойчивости, например, Кт и Ар Оба вектора способны временно поддерживаться в гес+-окружении в штаммах для упаковки in vivo (разд. 2.2.8.5), причем клетки содержат обе эписомы. [c.62]

Индукция профага приводит к упаковке космиды Кт , но не плазмиды Ар Однако если между фрагментами ДНК, клонированными в космиде и в плазмиде, имеется гомология, то между гомологичными последовательностями может с частотой 10 произойти рекомбинация, в результате которой оба вектора объединяются в одну крупную кольцевую космиду. Только в этом случае упаковка обеспечит возможность трансдукции обоих маркеров Д /п и Лр . Поэтому для клонирования какого-либо гена достаточно лишь вставить небольшой фрагмент его ДНК в плазмиду-зонд, содержащуюся в линии хелперных клеток, суперинфицировать их космидной библиотекой (упакованной, как указано в разд. 2.2.8.5), индуцировать профаг в хелперных клетках и высеять их на чашки с Km и Ар. Колонии с двойной лекарственной устойчивостью должны в принципе содержать ген, клонированный в космиде, в которую интегрировала плаз-мида-зонд. [c.62]

Идея создания и применения космидных векторов основана на возможности упаковки in vitro последовательностей ДНК, содержащих os-сайты, в частицы фага X. При этом получается инфекционный фаг, который затем с высокой эффективностью [c.74]

Упаковку космид in vivo можно применять при многих видах работ с космидными клонами и библиотеками. Основное достоинство данного подхода при амплификации библиотек — простота работы с упакованными космидами. Как и библиотеки, полученные на основе Я-векторов, космиды хорошо хранятся при 4 °С в виде фаговых суспензий, что позволяет легко оттитровать космидный препарат. При комнатной температуре препарат стабилен и хорошо выдерживает транспортировку. [c.76]

Главное условие для проведения экспериментов по космид-но-плазмидной рекомбинации — это отсутствие гомологии в последовательностях обоих векторов, так как это исключит возможность их гомологичной рекомбинации между иими. Кроме того, необходимо ввести космидную библиотеку, исходно сконструированную и амплифицированную в г< сЛ"-клетке, в полноценный по рекомбинации штамм, несущий селективную плазмиду (плазмиды). Наконец, необходимо обеспечить возможность селекции рекомбинантных космид после их повторного переноса в гесЛ -хозяина с тем, чтобы убедиться в стабильности клонов при их дальнейшем размножении. [c.78]

Принцип метода схематически показан на рис. 3.2. Космидные библиотеки, сконструированные в гесЛ -клетке, упаковывают в Я-частицы, чтобы получить лизат с высоким титром трансдуцирующих частиц. Аликвоты упакованной библиотеки используют затем для заражения гес+-клеток, в которые предварительно введена последовательность (или последовательности) -зонд, клонированная в плазмиде, не имеющей гомологии с космидным вектором. Через 30 мин — 2 ч, в течение которых должна произойти рекомбинация, космиды вновь упаковывают в фаговые частицы. Упакованные космиды используют для заражения гесЛ -хозяина, проводя селекцию по обоим маркерам лекарственной устойчивости — плазмидному и космидному. Поскольку плазмида не несет os-последовательностей, она будет перенесена в реципиентные клетки только в случае рекомбинации с гомологичной последовательностью в космидном клоне. Для того чтобы восстановить исходную космиду, можно вновь разделить два клопа в результате второго рекомбинационного события и после переноса в нового хозяина идентифицировать ревертантов на индикаторных чашках. Как будет сказано ниже, точное восстановление, однако, не всегда возможно (или желательно). [c.78]

Недавно начали применять другие космидные или плазмид-ные векторы на базе репликонов, отличных от семейства olEl, которые также используют в рекомбинационных экспериментах в сочетании с подходящими векторами. В качестве примеров можно назвать селективные плазмиды, несущие область начала репликации R1 [11], космиды на основе pS lOl [17] и космидные векторы, использующие область начала репликации фага К [18]. [c.81]

Известно два основных нути желаемая структура может быть образована в один этап, нанример, в результате рекомбинации в пределах короткого района гомологии — при введении последовательностей, содержащихся в селекционной плазмиде, в специфический участок космидного клона (рис. 3.3). Примером может служить подстановка энхансерных или промоторных последовательностей в участок, предшествующий гену, введение селективных маркеров или индикаторных генов (устойчивости к неомицину, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, р-га-лактозидазы) под контроль промотора, который несет космида, или создание случайных составных сегментов, образованных гомологичными генами, принадлежащими космиде и плазмиде. При необходимости может быть использован перенос в клетки-хозяева, непермиссивные для репликации одного из этих компонентов, что позволяет элиминировать независимо реплицирующиеся плазмиды, возникающие в результате вторичных рекомбинационных событий. Сходным образом селекционные плазмиды с последовательностями, гомологичными космидному вектору, используют для введения специфических последовательностей (например, маркеров, селектируемых в эукариоти- [c.85]

Для контроля высейте отдельно клетки, а также продукт пробной незаконной ре-ко лбинации, проведенной с участием интактного селекционного плазмидного вектора (например, риС8). В качестве позитивного контроля может быть использована любая плазмида, обладающая гомологией с космидным вектором (ожидаемая частота рекомбинации составляет 10 =). [c.92]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология